王 磊， 張靜澤， 高文遠(yuǎn)*， 劉 振

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津300072;2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥廠，天津300380)

中藥復(fù)方發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)歸根到底是化學(xué)成分，其藥味配伍后化學(xué)成分質(zhì)與量的變化，使中藥材在配伍后表現(xiàn)為各種藥理學(xué)效應(yīng)及體內(nèi)代謝過(guò)程的改變。如附子與甘草在配伍后主要成分甘草酸與烏頭堿形成水不溶性絡(luò)合物而減少了附子中毒性成分的溶出［1］，同時(shí)與甘草單味藥材煎煮相比，附子與甘草配伍后甘草中黃酮類(lèi)成分的提取率提高了約1.5倍［2］。甘草黃酮有效對(duì)抗烏頭堿所引起的大鼠室性心率失常，且其烏頭堿體內(nèi)代謝過(guò)程也由于與甘草的配伍而發(fā)生改變。由此可見(jiàn)，中藥復(fù)方配伍研究從闡述其組成藥味性味與功效關(guān)系逐漸發(fā)展為深入闡明藥材配伍前后化學(xué)成分、藥效及體內(nèi)代謝過(guò)程的變化，對(duì)了解中藥復(fù)方復(fù)雜體系真正作用物質(zhì)基礎(chǔ)及發(fā)揮治療效應(yīng)的機(jī)制具有非常重要的意義。

枳殼和大黃均為中醫(yī)處方中常用中藥材，其配伍后化學(xué)成分的變化未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。枳殼大黃的配伍也是中藥胃腸安丸中的重要組成藥味，前期對(duì)胃腸安丸甲醇提取物中黃酮類(lèi)成分柚皮苷［3］以及5種蒽醌類(lèi)成分［4］進(jìn)行了定量分析。本實(shí)驗(yàn)探討了胃腸安丸組成中的枳殼與大黃兩味藥材在配伍后其中主要化學(xué)成分組成的變化，并對(duì)枳殼中4種黃酮類(lèi)成分及大黃中5種蒽醌類(lèi)成分進(jìn)行定量分析，以期揭示枳殼與大黃配伍后對(duì)化學(xué)成分的影響，為進(jìn)一步研究中藥復(fù)方胃腸安丸作用物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1樣品與試劑 胃腸安丸由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥廠生產(chǎn) (批號(hào)為WCAWD109002)。

對(duì)照品:蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、柚皮苷、橙皮苷 (定量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):110756-200310、0757-200206、110756-200110、1107996-200310、1107580-200409、110722-200610、110721-201014);蕓香柚皮苷 (定量測(cè)定用，尖峰天然產(chǎn)物有限公司，批號(hào):20091122);新橙皮苷 (定量測(cè)定用，天津一方科技有限公司，批號(hào):10081102)。

乙腈、甲醇為色譜純，冰醋酸、三氯甲烷為分析純 (天津康科德醫(yī)藥化工有限公司)。

枳殼、大黃藥材由天津樂(lè)仁堂藥廠提供，經(jīng)天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院高文遠(yuǎn)教授鑒定為枳殼正品Aurantii Fructus，大黃正品Rhei Radix et Rhizoma。

1.2 儀器 高效液相色譜儀 (Waters2414型高效液相色譜儀;Waters2998紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器);微量分析天平 (CP225D，Sartourius Co.);Kromasil色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);微量進(jìn)樣器(25 μL，Hamilton)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 指紋圖譜分析條件 流動(dòng)相為A乙腈-B1%醋酸水，梯度洗脫條件見(jiàn)表1;柱溫35℃;體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2.1.2 枳殼中黃酮苷測(cè)定條件 流動(dòng)相為乙腈-0.5%醋酸水溶液(20∶80)等度洗脫;柱溫35℃;體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。各對(duì)照品對(duì)應(yīng)色譜峰理論塔板數(shù)不小于4000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution process of mobile phase

2.1.3 大黃中蒽醌測(cè)定條件 流動(dòng)相為A甲醇-B0.5%醋酸水溶液，梯度洗脫，0～20 min，A為65%～85%;柱溫35℃;體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。各對(duì)照品對(duì)應(yīng)色譜峰理論塔板數(shù)不小于4000。

2.2 對(duì)照品溶液配制

2.2.1 黃酮混合對(duì)照品溶液配制 分別精密稱(chēng)取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得蕓香柚皮苷 103 μg/mL、柚皮苷657 μg/mL、橙 皮 苷 68 μg/mL、新橙皮苷 406 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別吸取各對(duì)照品溶液0.2、1、2、3、4 mL混合均勻，甲醇定容至10 mL，作為混合對(duì)照品貯備液，備用。

2.2.2 蒽醌混合對(duì)照品溶液配制 分別精密稱(chēng)取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得到蘆薈大黃素64 μg/mL、大黃酸 94 μg/mL、大 黃 素 104 μg/mL、大 黃 酚141 μg/mL、大黃素甲醚33 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別吸取各對(duì)照品溶液0.1、0.25、0.5、1、2 mL混合均勻，甲醇定容至10 mL，作為混合對(duì)照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 胃腸安丸供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定胃腸安丸粉末約1.0 g，置100 mL具塞三角瓶中，加甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量，濾過(guò)后備用。

2.3.2 枳殼供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定枳殼藥材粉末0.2 g，按照2.3.1項(xiàng)下制備方法制得枳殼供試品溶液，精密吸取本供試品溶液5 mL加甲醇定容于10 mL量瓶中，作為測(cè)定用供試品溶液。

2.3.3 大黃供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定適量大黃藥材粉末0.1 g，按照2.3.1項(xiàng)下制備方法制得大黃供試品溶液。精密吸取本供試品溶液5 mL加甲醇定容于10 mL量瓶中，作為測(cè)定用供試品溶液。

2.3.4 枳殼大黃供試品溶液的制備 按照胃腸安丸中枳殼大黃藥材配伍比例，精密稱(chēng)定枳殼大黃藥材 (2∶1)粉末，按照2.3.1項(xiàng)下制備方法制得枳殼大黃供試品溶液。

2.4 樣品HPLC指紋圖譜比較分析

按照2.1.1項(xiàng)下指紋圖譜測(cè)定條件對(duì)胃腸安丸、枳殼、大黃、枳殼-大黃配伍及缺大黃、枳殼陰性組方甲醇提取物供試品進(jìn)行HPLC分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1中所示在本實(shí)驗(yàn)分析條件下胃腸安丸甲醇提取物中的50余個(gè)色譜峰得到了較好的分離，通過(guò)與枳殼、大黃藥材以及缺藥材陰性提取物色譜圖比較發(fā)現(xiàn)，胃腸安丸甲醇提取物中的主要成分來(lái)自枳殼和大黃。枳殼與大黃配伍后HPLC色譜圖結(jié)果顯示，配伍前后化學(xué)成分僅為單味藥材化學(xué)成分疊加并無(wú)新成分生成，所含主要成分在量上存在一定差異，因此對(duì)枳殼和大黃中的兩類(lèi)主要成分黃酮類(lèi)及蒽醌類(lèi)成分進(jìn)行定量分析。

圖1 胃腸安丸、枳殼大黃及其配伍甲醇提取物HPLC指紋圖譜Fig.1 Typical HPLC-UV chromatograms of weichang'an Pills，Aurantii Fructus，Rhei Radix et Rhizoma，and the compatibility of them

2.5 主要成分測(cè)定方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別按照2.1.2項(xiàng)和2.1.3項(xiàng)下黃酮苷和蒽醌類(lèi)成分色譜分析條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液配制成一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，液相色譜圖如圖2、3所示，分別記錄峰面積。以枳殼中4種黃酮苷及大黃中5種蒽醌對(duì)照品質(zhì)量濃度 (X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值 (Y)為縱坐標(biāo)分別進(jìn)行線性回歸，所得線性回歸方程及相關(guān)參數(shù)如表2所示，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定條件下各成分在線性范圍內(nèi)對(duì)照品濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表2 9種對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)參數(shù)Tab.2 Calibration data of nine reference substances

2.5.2 精密度試驗(yàn) 按2.1.2項(xiàng)及2.1.3項(xiàng)下色譜條件，黃酮及混合蒽醌類(lèi)成分對(duì)照品溶液分別連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，考察精密度，記錄混合對(duì)照品各組分峰面積值，分別計(jì)算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按照供試品溶液制備方法配制溶液，分別精密稱(chēng)取5份枳殼與大黃配伍藥材，制備枳殼大黃配伍提取物，按2.1.2項(xiàng)和2.1.3項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定考察方法重復(fù)性，記錄混合對(duì)照品各組分峰面積值，計(jì)算RSD值。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一份供試品溶液避光室溫放置，在0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣20 μL考察穩(wěn)定性按照2.1.2和2.1.3項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定考察測(cè)定成分在實(shí)驗(yàn)分析條件下的穩(wěn)定性，記錄供試品中各測(cè)定成分峰面積，計(jì)算RSD值。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含有量枳殼大黃配伍樣品，共6份，分別置上述具塞三角瓶中，按照供試品溶液配制方法進(jìn)行制備后，精密吸取供試品溶液5 mL分別加入1 mL黃酮苷對(duì)照品溶液(加入量分別為蕓香柚皮苷103 μg;柚皮苷657 μg;橙皮苷68 μg;新橙皮苷406 μg)以及蒽醌對(duì)照品溶液0.2 mL(加入量分別為蘆薈大黃素32 μg;大黃酸19 μg;大黃素52 μg;大黃酚70 μg;大黃素甲醚16 μg)后加甲醇定容至10 mL量瓶中。按照

圖2 枳殼大黃配伍前后黃酮類(lèi)成分測(cè)定HPLC色譜圖Fig.2 Typical HPLC-UV chromatograms of compatibility of Aurantii Fructus and Rhei Radix et Rhizoma

圖3 枳殼大黃配伍前后蒽醌類(lèi)成分測(cè)定HPLC色譜圖Fig.3 Typical HPLC-UV chromatograms of compatibility of Aurantii Fructus and Rhei Radix et Rhizoma

2.1.2項(xiàng)和2.1.3項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。

以上方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明該分析條件下儀器精密度，方法重復(fù)性及回收率良好，且供試樣品溶液在24 h內(nèi)室溫放置穩(wěn)定性良好，采用該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.6 樣品測(cè)定 取枳殼大黃粉末按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法分別制成枳殼、大黃、枳殼大黃供試品溶液，每組制備三份。精密吸取供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 測(cè)定方法精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Precisions，reproducibility and stability of references and samples

3 討論

前期研究表明胃腸安丸甲醇提取物對(duì)腸運(yùn)動(dòng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)在其能夠促進(jìn)正常小鼠小腸推進(jìn)率，而預(yù)先采用新斯的明致瀉小鼠，胃腸安對(duì)腸運(yùn)動(dòng)的異?？哼M(jìn)具有明顯的抑制作用［5］。利用HPLC分析了胃腸安丸甲醇提取物中主要成分，結(jié)果顯示主要成分中以藥材枳殼、大黃中的成分所占比例較大。枳殼中主要含有黃酮及其苷類(lèi)、香豆素、生物堿及揮發(fā)油類(lèi)等成分［6-7］，其中以黃酮及其苷類(lèi)為主要成分;大黃中則主要以蒽醌類(lèi)成分為主，尚含有鞣質(zhì)、二苯乙烯苷類(lèi)化合物［8］。枳殼大黃配伍后化學(xué)成分種類(lèi)繁多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乙腈-0.5%梯度洗脫條件下，多數(shù)成分達(dá)到基線分離，達(dá)到良好的分離效果。枳殼中黃酮苷類(lèi)成分的紫外吸收最大值在283 nm，蒽醌類(lèi)成分在250 nm左右，因此實(shí)驗(yàn)中選定兩個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，在280 nm條件下對(duì)枳殼中黃酮類(lèi)進(jìn)行測(cè)定，在254 nm條件下測(cè)定蒽醌類(lèi)成分含量，各成分吸收響應(yīng)好，雜質(zhì)干擾較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)胃腸安丸中黃酮苷和蒽醌類(lèi)成分進(jìn)行了初步的研究，雖為揭示胃腸安丸中該兩類(lèi)化學(xué)成分提供了一定信息，但胃腸安中其它藥味等配伍對(duì)其化學(xué)成分的變化與否還有待進(jìn)一步深入研究。

表4 主要成分測(cè)定結(jié)果Tab.4 Contents of references in the samples.

枳殼水煎劑及辛弗林對(duì)腸平滑肌收縮起明顯抑制作用［9］，而大黃中蒽醌類(lèi)化合物是具有瀉下作用的成分［10，11］。枳殼與大黃配伍后枳殼中的4種黃酮類(lèi)成分含有量均有不同程度的增加。董玄等［12］利用HPLC方法測(cè)定了不同產(chǎn)地枳殼中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷，本研究中增加了枳殼中蕓香柚皮苷定量測(cè)定，比較了枳殼中4種黃酮苷類(lèi)成分在配伍前后的變化，同時(shí)，比較了大黃中蒽醌類(lèi)成分配伍前后的改變情況，從游離蒽醌含有量變化可見(jiàn)，枳殼與大黃配伍后游離型大黃酸含有量增加最為顯著，增加了5.17倍，同時(shí)游離型大黃酚及大黃素甲醚的含有量分別增加了2.39、2.13倍。而結(jié)合型蒽醌含有量變化并不明顯，蒽醌類(lèi)化合物總量由2.39%增加到3.3%。

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