徐曉婷 李金利 秦頌兵 周菊英

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國常見的惡性腫瘤之一，放療是目前根治鼻咽癌的公認和有效的手段。20余年來，隨著鼻咽癌影像學、放療技術及設備研發(fā)的進展，鼻咽癌早期的局部控制率可達70%~90%，但晚期（Ⅲ、Ⅳ期）僅為50%，5年總生存率（OS）僅40%~70%[1]。因此，如何提高鼻咽癌放射治療的敏感性始終是該領域的研究熱點。20世紀70年代，F(xiàn)olkman[2]首次提出通過抑制血管生長、切斷營養(yǎng)供給而達到抑制并消除腫瘤的設想。重組人血管內皮抑制素注射液（商品名：恩度）是在內皮抑素的結構基礎上，在母體的N端添加了9個氨基酸殘基序列，較內皮抑素對蛋白酶、酸、熱的穩(wěn)定性更佳[3]。本研究旨在研究恩度聯(lián)合放療對鼻咽癌的抑制作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和裸鼠 人鼻咽癌細胞株CNE1購于中國科學院上海細胞研究所，BALB/c（nu/nu）裸鼠24只，雌性，4周齡，體質量15~18 g，購于中國科學院上海動物中心[動物合格證號：SCXK（滬）2008-0005]，蘇州大學動物中心SPF級條件下統(tǒng)一飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶（美國GIBCO公司），小牛血清（杭州四季青公司）；恩度注射液（南京先聲藥業(yè)有限公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；MMLV（Promega公司）；DEPC（BBI公司）；Ex TaqTMR-PCR Version 2.1（大連寶生物公司，DRR031）；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Survivin和6對隨機引物（上海生工生物公司）。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（上海HERAEUS BB5060型）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS CK-2型）；ABI 9600低溫高速離心機（德國Heraeus公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立鼻咽癌裸鼠成瘤模型 在CNE1細胞處于指數(shù)生長期，細胞總量充足，以0.25%胰蛋白酶將細胞消化后，調整細胞濃度至2.5×107個/mL，按0.2 mL/只推注入裸鼠右后肢腹股溝皮下。

1.2.2 成瘤后隨機分組并實施干預 接種瘤細胞后每天觀察裸鼠精神狀態(tài)、飲食、對外界的反應及成瘤情況等，成瘤后每4 d測量腫瘤體積V=LD×SD2×0.5（LD：腫瘤最長徑，SD：腫瘤最短徑）。當成瘤體積增至300~500 mm3時，隨機將裸鼠分為對照組、恩度組、放療組及恩度+放療聯(lián)合組（聯(lián)合組），每組6只。對照組：瘤周注射生理鹽水0.2 mL/次，1次/d，連續(xù)10 d；恩度組：每只裸鼠20 mg/（kg·d）瘤周注射恩度注射液，連續(xù)10 d；放療組：成瘤處以5 MeV局部單次20 Gy照射；聯(lián)合組：將恩度組和放療組的處理方法同時處理此組。

1.2.3 觀察腫瘤生長延遲情況 計算絕對延遲時間和標準化延遲時間[4]。絕對延遲時間是指每個實驗組腫瘤增大至原來體積的2倍所需的時間減去對照組腫瘤增大至原來體積的2倍所需時間；而標準化延遲時間是指聯(lián)合組的絕對延遲時間減去對應單純治療組的絕對延遲時間。在此基礎上，計算聯(lián)合組內的恩度對放射的增效因子（enhencement factor，EF），即聯(lián)合組的標準化生長延遲時間與放療組的絕對生長延遲時間的比值。28 d后采用頸椎脫位處死裸鼠，摘取瘤體并稱瘤重。電鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學變化。

1.2.4 實時熒光定量PCR（Real time-PCR）檢測VEGF和Sur?vivin的表達 （1）VEGF和Survivin引物的設計。VEGF上游：5′-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3 ′，下游：5′-TCACCGC CTCGGCTTGTCACA-3′；Survivin上游：5′-GCCAGATTTGAA TCGCGGGA-3′，下游：5′-GCAGTGGATGAAGCCAGCCT-3′。（2）瘤組織RNA的提取及cDNA的合成。管1：隨機引物2 μL，RNA 4 μL，DEPC H2O 9 μL 70 ℃，5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；管2：5×Buffer 8 μL，MMLV 1 μL，Rnasin 0.5 μL，dNTP 1.25 μL，加H2O 14.25 μL；將管2加入管1中，37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，4℃，12 000 r/min離心5 min。（3）Real time-PCR。5×buffer 5 μL，Mg2+0.25 μL，dNTP 0.75 μL，TaqMen 0.25 μL，Primer 1，0.5 μL，Primer 2，0.5 μL，Probe 0.3 μL，dH2O 15.45 μL，ample 2 μL 95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s 60 ℃ 60 s，50個循環(huán)4℃，12 000 r/min離心5 min。（4）Real time-PCR結果判定與分析。采用GAPDH作為內參，根據(jù)標準曲線得出待測基因mRNA的分子拷貝數(shù)。經(jīng)可行性試驗驗證目的基因與內參的擴增斜線差值小于0.1，應用△△Ct法進行定量分析?；蛳鄬α?2-△Ct，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因；實驗組/對照組的相對量為2-△△Ct，△△Ct=實驗組△Ct-對照組△Ct，2-△△Ct值越大，目標基因VEGF和Survivin mRNA的相對量越小。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用x ±s表示；多組數(shù)據(jù)組間分析分別應用方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t法；相關性的判定用Pearson直線相關分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠接種后成瘤及生長狀況 裸鼠接種后12~15 d形成肉眼可見的皮下移植瘤，成瘤率100%；移植瘤早期多呈類球形，隨著腫瘤的生長，逐漸呈不規(guī)則形，表面出現(xiàn)結節(jié)或分葉狀突起；成瘤初期各組裸鼠飲食、活動及對外界的反應無明顯改變，隨著腫瘤的不斷增長，逐漸出現(xiàn)進食活動減少，體質量減輕，對外界反應遲鈍等異常。

2.2 成瘤生長情況 聯(lián)合組腫瘤體積增長受到明顯抑制，少數(shù)腫瘤停止生長，但均未出現(xiàn)腫瘤消退情況；對照組生長迅速；恩度組與放療組居中，見圖1。聯(lián)合組的腫瘤倍增時間長于其他3組，放療組的腫瘤倍增時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），恩度組的腫瘤倍增時間與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；增效因子為1.23，見表1。

2.3 電鏡觀察腫瘤組織凋亡情況 對照組瘤細胞形態(tài)不規(guī)則，絨毛豐富，細胞器結構清晰，核形態(tài)不規(guī)則，核漿比大，核內異染色質豐富；恩度組癌細胞數(shù)量較多，腫瘤細胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)改變少見；放療組癌細胞數(shù)量減少，部分腫瘤細胞可見典型的凋亡改變；聯(lián)合組在電鏡視野里腫瘤細胞數(shù)稀少，腫瘤細胞損傷嚴重，核固縮，核均質化溶解及核碎裂，細胞膜破裂形成細胞碎片，見圖2。

2.4 4組裸鼠成瘤組織中VEGF、Survivin表達水平比較 恩度組、放療組和聯(lián)合組的VEGF表達水平均低于對照組，聯(lián)合組低于放療組和恩度組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），恩度組、放療組和聯(lián)合組的Survivin表達水平均小于對照組，聯(lián)合組小于放療組和恩度組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

2.5 VEGF與Survivin表達的相關性 成瘤組織中VEGF與Survivin的表達呈正相關（r=0.679，P<0.01）。

Figure 1 Growth curves of different treatment groups圖1 治療后各組成瘤生長曲線

Table 1 Inhibitory effects of endostar combined with radiotherapy on transplanted CNE1 nasopharyngeal carcinoma表1 放療聯(lián)合恩度對鼻咽癌CNE1成瘤的抑制效應（±s）

Table 1 Inhibitory effects of endostar combined with radiotherapy on transplanted CNE1 nasopharyngeal carcinoma表1 放療聯(lián)合恩度對鼻咽癌CNE1成瘤的抑制效應（±s）

**P＜0.001

對照組（1）恩度組（2）放療組（3）聯(lián)合組（4）F腫瘤倍增時間（d）9.0±1.0 12.0±2.3 26.0±4.7 35.0±5.4 49.846**絕對生長延遲（d）-3.0±1.3 17.0±3.7 26.0±4.4標準化生長延遲（d）---23±3.1增效因子---1.23組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）P 0.298<0.001<0.001<0.001 0.022統(tǒng)計學處理組別

Figure 2 The cell apoptosis of tumor tissues detected by electron microscope（×4 800）圖2 各組瘤細胞凋亡的電鏡圖（×4 800）

Table 2 Expression levels of VEGF andSurvivin mRNA in tumor tissues表2 各組裸鼠鼻咽癌成瘤組織中VEGF和Survivin的表達水平 （n=6±s）

Table 2 Expression levels of VEGF andSurvivin mRNA in tumor tissues表2 各組裸鼠鼻咽癌成瘤組織中VEGF和Survivin的表達水平 （n=6±s）

**P＜0.01

VEGF（2-△△Ct）1.000±0.787 2.128±0.399 2.473±0.577 5.319±1.014 31.532**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）P 0.027<0.001<0.001<0.001<0.001 Survivin（2-△△Ct）1.000±0.864 2.990±1.072 3.624±1.182 7.868±2.995 13.619**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（4）（3）∶（4）P 0.019 0.031<0.001<0.001<0.001統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學處理對照組（1）恩度組（2）放療組（3）聯(lián)合組（4）F組別

3 討論

局部晚期鼻咽癌患者鼻咽部腫瘤和頸部轉移淋巴結較大，腫瘤內乏氧細胞多，放療效果差，且遠處轉移率高達20%~40%[1]。乏氧的環(huán)境促進腫瘤血管的生成，腫瘤血管的生成又可以促進腫瘤放療后的加速再增殖[5]。因此，如何提高腫瘤乏氧細胞的放射敏感性是本領域最為關注的問題之一。VEGF能特異性刺激血管內皮細胞的增殖，抑制其凋亡，促進血管構建，還具有促進淋巴管形成及腫瘤細胞淋巴轉移的作用?？寡苌莎煼芨慕[瘤紊亂的血管網(wǎng)，使之結構、功能趨于正?；?，從而改善血液循環(huán)，改善腫瘤的乏氧狀態(tài)，提高乏氧細胞的放射敏感性[6]。本實驗選取拮抗VEGF受體的有效抗體恩度進行鼻咽癌放射增敏實驗，移植瘤生長抑制實驗結果表明：聯(lián)合組的腫瘤生長速度明顯低于其他實驗組，腫瘤生長延遲時間較放療組明顯延長（增效因子=1.23），說明恩度對裸鼠皮下成瘤的鼻咽癌有良好的放療增敏效應。

Winkler等[7]發(fā)現(xiàn)，抗VEGF受體抗體能誘導腫瘤血管出現(xiàn)一個“血管正常化的窗口期”，窗口期內腫瘤血管與正常血管功能相似，腫瘤含氧量高，腫瘤細胞對放射線敏感，在窗口期內放療能起到較好的協(xié)同抗腫瘤作用。達到腫瘤“血管正常化窗口期”正是目前臨床應用恩度所關注的焦點。本實驗在連續(xù)使用恩度10 d后再進行腫瘤的放療，取得了較好的放療增敏效果，提示連續(xù)給藥10 d后可能是腫瘤血管正常化的“窗口期”，這種藥物和放療序貫使用的方式為臨床使用恩度增敏放療提供一定的參考。

VEGF表達的高低體現(xiàn)頭頸部腫瘤放療的療效，VEGF表達越高，腫瘤放療預后效果越差[8]。本實驗結果表明：聯(lián)合組與恩度組、放療組相比，VEGF的表達都明顯降低，提示恩度和放療的聯(lián)合使用對抑制腫瘤中VEGF的表達有協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)各種腫瘤組織在放療后表現(xiàn)為VEGF表達水平上調，可能是機體在受到照射后產(chǎn)生的一種保護機制，誘導腫瘤產(chǎn)生放療抗拒[9]。VEGF保護放療誘導的血管內皮細胞凋亡，而此作用可以被抗VEGF抗體阻滯，因而恩度可能通過下調VEGF的表達提高腫瘤細胞的放射敏感性，強化了放療的細胞毒作用。本實驗中放療組VEGF的表達也低于對照組，這可能與單次大劑量放療后腫瘤負荷降低，VEGF的表達出現(xiàn)下降有關。

抗凋亡蛋白Survivin在所有人類腫瘤和轉化的細胞系中大量表達，其可抑制腫瘤細胞的凋亡，促進細胞的異常增殖和惡性轉化，且還被證實參與血管的形成，可能的作用機制是介導VEGF促進血管生成，抑制血管內皮細胞的凋亡，降低放化療的敏感性[10]。本實驗結果顯示聯(lián)合組與恩度組、放療組相比，Survivin的表達明顯降低，同時聯(lián)合組的VEGF和Survivin表達均低于對照組，且兩者的表達呈正相關。可見恩度與放療聯(lián)合作用于裸鼠的鼻咽癌成瘤組織，通過下調Survivin的表達，從而抑制VEGF的抗凋亡活性，增加了放療后腫瘤細胞的凋亡，起到放射增敏的作用。

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