張亞娟，王亞楠，丁亞駿，何璐云，劉 鑫，康巧珍

(鄭州大學(xué)生物工程系 河南鄭州 450001)

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘)是一種慢性反復(fù)發(fā)作的、由多種細(xì)胞(尤其是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T細(xì)胞)和細(xì)胞因子參與的氣道變態(tài)反應(yīng)性疾?。?］，在抗原刺激時(shí)會(huì)引起支氣管平滑肌收縮、腺體分泌增多和黏膜血管擴(kuò)張，最終導(dǎo)致支氣管管腔狹窄、呼吸困難，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡。目前哮喘的發(fā)病率和死亡率逐年增長(zhǎng)，尚無(wú)根治的辦法，嚴(yán)重困擾著人類的健康。關(guān)于哮喘發(fā)病機(jī)制的探索、哮喘新藥的研究與開(kāi)發(fā)、新治療方法的評(píng)價(jià)都主要依賴于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［2］。目前國(guó)外大多數(shù)選用BALB/c小鼠來(lái)構(gòu)建哮喘模型，但由于國(guó)內(nèi)外不同的實(shí)驗(yàn)條件，國(guó)外文獻(xiàn)提及的哮喘模型建立方法在國(guó)內(nèi)并不完全適用［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合了國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的報(bào)道，通過(guò)控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條件、致敏方法等，建立了1個(gè)穩(wěn)定的小鼠哮喘模型，以便于支氣管哮喘的研究及治療。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6周齡，健康的雌性BALB/c小鼠16只(鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，隨機(jī)分為兩組，A組8只，為對(duì)照組，以生理鹽水代替OVA(Grade V Sigma公司)致敏和激發(fā);B組8只，為模型組，用OVA致敏和激發(fā)。

1.2 主要試劑與儀器 卵清蛋白OVA，氫氧化鋁(Sigma公司)，402AI超聲霧化器。

1.3 哮喘小鼠模型的建立

1.3.1 動(dòng)物致敏:B組小鼠分別于第0天和第14天腹腔注射新配置的致敏液0.2 ml(每0.2 ml致敏液中含有OVA粉末10 μg，氫氧化鋁粉末20 mg)致敏;A組小鼠用生理鹽水代替致敏液，注射部位及劑量相同［4］。

1.3.2 動(dòng)物激發(fā):用生理鹽水配制濃度為1% 的OVA溶液，即得霧化液。于第28～30天，將B組小鼠置于5 L自制密閉容器中，以霧化液霧化吸入激發(fā)(402AI型超聲霧化器提供霧化動(dòng)力)，使小鼠暴露在OVA氣霧中，每天30 min;A組小鼠在相同條件下以生理鹽水代替霧化液霧化吸入激發(fā)，實(shí)驗(yàn)中尤其要注意觀察霧化過(guò)程中模型組小鼠出現(xiàn)的陽(yáng)性反應(yīng):腹肌抽搐、呼吸急促、大小便失禁等［5］。

1.4 肺泡灌洗液收取及細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 在最后1次霧化24 h后脫臼處死小鼠，消毒分離出氣管，剪開(kāi)氣管，把2 ml注射器針頭插入氣管內(nèi)并固定。每次注入生理鹽水 0.8 ml，回抽，共2次(回抽率達(dá) 85%以上)［4］。將 BALF 于 1 200 r/min，4 ℃ 離心 10 min，離心兩次，沉渣重懸后涂片行瑞氏－姬姆薩復(fù)合染色，然后進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.5 肺組織病理切片的染色 在兩組小鼠肺泡灌洗后取肺，并用生理鹽水8～10 ml沖洗，福爾馬林固定，進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)觀察 A組小鼠無(wú)癥狀;B組小鼠出現(xiàn)煩躁不安，弓背抓臉，呼吸急促，前肢縮抬，腹肌抽搐，大小便失禁，最后安靜少動(dòng)等癥狀。

2.2 BALF白細(xì)胞分類計(jì)數(shù) BALF中白細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)見(jiàn)表1。A組小鼠BALF中EOS%(2.12 ±0.58)，B 組小鼠 BALF 中 EOS%(17.20 ± 4.19)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.52，P ＜0.001)。

表1 BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS計(jì)數(shù)

2.3 小鼠肺組織病理改變 肉眼可見(jiàn)模型組小鼠肺臟體積比對(duì)照組明顯增大;肺臟表面腫脹，有暗紅色充血區(qū)域，且充血區(qū)域形狀不規(guī)則;組織切面有白色泡沫狀的物質(zhì)滲出。將肺組織切片行HE染色后，光鏡下可看到支氣管和其伴行血管周圍有較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮有多處斷裂，基底膜增厚明顯且形態(tài)不規(guī)則［6］。見(jiàn)圖 1。

圖1 小鼠肺組織切片的光鏡觀察(HE染色，×100)

3 討論

支氣管哮喘是一種嚴(yán)重的呼吸道過(guò)敏反應(yīng)性疾病，也是常見(jiàn)的威脅人類健康的慢性呼吸道疾病。目前全球支氣管哮喘患者人數(shù)高達(dá)3億多，且哮喘的發(fā)病率一直在上升，近10年來(lái)我國(guó)哮喘兒童人數(shù)上升了60%，引起了世界各國(guó)科研工作者的重視。因此，建立一種可靠的哮喘模型對(duì)研究哮喘的發(fā)病機(jī)制及治療十分重要。

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的哮喘模型種類繁多，雖不能完全模擬人類哮喘的病理生理過(guò)程，但都產(chǎn)生了支氣管哮喘的典型癥狀，如支氣管上皮損傷、黏液過(guò)度分泌、肺內(nèi)EOS% 增多、肺組織切片可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠在霧化激發(fā)期間出現(xiàn)了比較明顯的哮喘急性發(fā)作癥狀;模型組BLAF中EOS%較對(duì)照組明顯增加;病理表現(xiàn)具體為:肺組織水腫、腺體分泌增多、基底膜增厚、氣管變形、氣道上皮脫落、肺組織切片HE染色后可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、尤其是嗜酸性粒細(xì)胞增多等表現(xiàn)［3］，符合哮喘的病理學(xué)特征。

以上結(jié)果表明，此模型能夠用于哮喘的實(shí)驗(yàn)研究，此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建對(duì)支氣管哮喘的研究和治療具有重要意義。然而對(duì)于此模型中存有的一些缺點(diǎn)和不足，需要在我們以后的研究和工作中不斷地認(rèn)識(shí)、改進(jìn)和完善。

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