周秀錦，楊 建，周向陽，沈 飚，吳祖芳

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316100；2.應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波 315211)

鰹魚(Eleotridae)，俗稱為炸彈魚，屬鱸形總目、金槍魚亞目、金槍魚科、鰹屬，我國只產(chǎn)一種；鰹魚肉中含有豐富的血紅蛋白和肌紅蛋白，在有生命活動的組織內(nèi)，血紅蛋白與肌紅蛋白處于平衡狀態(tài)，而魚體死后經(jīng)氧化生成的高鐵肌紅蛋白則呈現(xiàn)不良的棕紅色[1]。一般認為，肌紅蛋白的化學(xué)狀態(tài)是影響魚肉顏色的根本所在[2]。同時由于魚肉中的組氨酸在組胺細菌脫羧酶的作用下，發(fā)生脫羧反應(yīng)生成組胺[3]。海水中存有污染魚類的組胺菌，組胺生成菌普遍存在于海水魚的體表，也生活在活魚的鰓和內(nèi)臟中。魚死亡時，在貯藏或加工過程中體內(nèi)組氨酸經(jīng)過內(nèi)源性或外源性微生物產(chǎn)生的脫羧酸酶降解后產(chǎn)生的對產(chǎn)品品質(zhì)(感官指標)劣化或人體有一定毒害的化學(xué)物質(zhì)[4]。鰹魚罐頭是我國某些沿海城市重要的出口水產(chǎn)加工品，暢銷日本、歐洲等國家；自中國加入世界貿(mào)易組織，出口量不斷增加，但是組胺含量超標，一直是制約產(chǎn)品出口的主要瓶頸，因組胺含量超標而引起的中毒事件也時有發(fā)生[5-7]。本文建立了培養(yǎng)基中組胺的高效液相色譜法(HPLC)檢測方法，確定從鰹魚魚肉組織中分離產(chǎn)組胺微生物，研究菌株的生長和產(chǎn)組胺特性，研究結(jié)果可為冷凍水產(chǎn)品組胺含量相關(guān)的質(zhì)量安全控制提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

冷凍鰹魚(捕撈于中國東海，捕撈后于-30℃下速凍，-18℃保藏)，浙江舟山企業(yè)提供(2010年4月)，無菌袋包裝、冷藏，于5 h內(nèi)運到實驗室，-18℃保藏，以備試驗用。

組胺標準品購自Sigma公司，丹磺酰氯購自ACROS公司，L-組氨酸和1,7-二氨基庚烷購自阿拉丁試劑公司，乙腈和甲醇購自迪馬公司；色譜分析所用試劑：色譜純；其他試劑：均為化學(xué)純和分析純。

組胺發(fā)酵培養(yǎng)基：L-組氨酸10 g，大豆蛋白胨17g，NaCl 3.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，丙酮酸鈉10.0 g，葡萄糖2.5 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 7.0，分裝試管。培養(yǎng)基于1.01×105Pa高壓下，121℃蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-190-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購自廣東省醫(yī)療器械廠；LDZX-40BI立式蒸汽滅菌鍋，購自上海申安醫(yī)療器械廠；安捷倫LC1100液相色譜儀，購自美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)液中組胺檢測方法的建立

1.3.1.1 發(fā)酵液預(yù)處理

取各菌株發(fā)酵液及空白對照各1 mL于5 mL離心管，依次加入100 μL 2 mol/L氫氧化鈉，20 μL 100 mg/L 1,7-二氨基庚烷(內(nèi)標物，用0.1 mol/L鹽酸配制而成)標準使用液，300 μL飽和碳酸氫鈉，再加入2 mL丹酰氯衍生劑溶液(用色譜級丙酮配制成濃度為10 mg/mL)進行衍生，震蕩混勻后于60℃烘箱內(nèi)放置45 min，再加入100 μL氨水放置40 min，最后用乙腈定容至5 mL，震蕩混勻，取1 mL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。

1.3.1.2 標準曲線預(yù)處理

取 0 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1 000 μL 的 10 μg/mL 組胺標準溶液，經(jīng) 1.3.1.2 加入 20 μL 100 mg/L 1,7-二氨基庚烷……衍生處理后，通過高效液相測定。

1.3.1.3

色譜條件：流動相A：0.01 mol/L乙酸銨，流動相B：乙腈與0.01 mol/L乙酸銨9:1混合；流動相A：流動相B=2:8，流速1.0 mL/min，紫外檢測器波長254 nm，進樣量20 μL。

1.3.2 待測菌株產(chǎn)組胺能力的測定

取1 mL初步分離菌株菌懸液接種于9 mL組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中(此時菌液濃度約為104 CFU/mL)，并設(shè)置空白對照組(不接種菌株)，35℃下靜置恒溫培養(yǎng)36 h，檢測發(fā)酵液是否有組胺產(chǎn)生。

1.3.3 溫度對產(chǎn)組胺菌株生長和產(chǎn)組胺的影響

取1 mL產(chǎn)組胺菌株的菌懸液接種至9 mL組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中，分成五組分別于4℃、20℃、25℃、30℃和35℃下靜置培養(yǎng)36 h，每個溫度均設(shè)置空白對照；取1 mL通過高效液相色譜法測定組胺含量。

1.3.4 pH對產(chǎn)組胺菌株生長和產(chǎn)組胺的影響

取1 mL菌懸液接種于9 mL pH為4，5，6，7和8的組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中(每個pH設(shè)置空白對照)，30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)36 h；測定發(fā)酵液中的組胺含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)液中組胺檢測方法的建立

2.1.1 樣品前處理的優(yōu)化

在樣品處理過程中加入100 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)整培養(yǎng)液pH呈堿性，致使組胺能游離便于衍生。衍生化后添加乙腈，充分沉淀培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，減少待測液中的大分子物質(zhì)，保護檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定，延長色譜柱的使用壽命。

2.1.2 標準工作曲線

組胺的線性范圍、校正曲線方程和相關(guān)系數(shù)見表1。組胺標準溶液和內(nèi)標物色譜圖如圖1所示。

圖1 組胺標準溶液和內(nèi)標色譜圖Fig.1 Chromatogram of histamine standard and internal

表1 組胺的線性范圍、校正曲線方程和相關(guān)系數(shù)Tab.1 The linearity of standard curve

注：表中x，y分別為組胺與內(nèi)標濃度比和峰面積比.

2.1.3 回收率和精密度、方法的測定低限

在空白培養(yǎng)液中添加 0.5 μg/mL、2.0 μg/mL、10.0 μg/mL 的組胺，按本文的實驗方法操作，所得回收率和室內(nèi)精密度見表2。由表2可知，此方法的平均加標回收率為104.1%～103.8%，回收率較好。

表2 培養(yǎng)液中組胺回收率與精密度試驗數(shù)據(jù)Tab.2 Results of recovery test and precision of the method from fortified samples(n=6)

在空白培養(yǎng)液樣品中添加0.5 μg/mL的組胺標準溶液，按本文的實驗方法操作，回收率均在100%～107%之間，相對標準偏差＜15%，符合殘留分析的要求?？瞻讟悠泛图訕撕髽悠方M胺的色譜對比圖如

圖2。根據(jù)回收率試驗，本方法的測定低限為 0.5 μg/mL。

圖2 空白樣品和加標后樣品組胺的色譜對比圖Fig.2 Chromatogram of spiked histamine sample and bank sample by HPLC

2.2 溫度對產(chǎn)組胺菌株產(chǎn)組胺的影響

將產(chǎn)組胺菌株菌懸液接種至組胺發(fā)酵培養(yǎng)基中(此時菌濃度約為104CFU/mL)，分成5組(每組至少3個平行)在4℃、20℃、25℃、30℃和35℃條件下靜置培養(yǎng)36 h(每個溫度均設(shè)置空白對照)，測定培養(yǎng)液中組胺含量，結(jié)果如圖3。

從圖3可以看出，4℃時，均未檢測J2和J4產(chǎn)生組胺，表明此溫度下2株菌不能產(chǎn)生組胺，20～35℃溫度范圍內(nèi)，組氨酸脫羧酶均有較強活性，且J2和J4分別在25℃和30℃時活性達到最強，檢測到組胺最大生成量分別為5.49 mg/L和12.47 mg/L，降低或升高溫度均使活性減弱。其中J2生長最適溫度與產(chǎn)組胺最適溫度不同，表明該菌生長最適溫度與酶作用的最適溫度不同。

2.3 pH對產(chǎn)組胺菌株產(chǎn)組胺的影響

將組胺發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別調(diào)至4，5，6，7和8，然后取1 mL J2和J4菌懸液接種于裝有9 mL培養(yǎng)基的試管中，35℃靜置培養(yǎng)36 h(每個pH均設(shè)置空白對照)，測定培養(yǎng)液中組胺含量，結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出，菌株J2和J4在pH=5時有最大組胺生成量9.86 mg/L和12.02 mg/L，且都隨著pH升高而降低，兩株菌在pH=4時組胺產(chǎn)生量少于在pH=5時，這可能與該pH下細菌總數(shù)有關(guān)。

圖3 溫度對J2和J4產(chǎn)組胺的影響Fig.3 Effect of the temperature on histamine production of histamine-forming bacteria

圖4 pH對菌株J2和J4產(chǎn)組胺的影響Fig.4 Effect of the pH on histamine production of histamine-forming bacteria

3 討論

利用高效液相色譜內(nèi)標法檢測發(fā)酵液中組胺含量，發(fā)酵液前處理的方法在CHEN等[5]所用方法的基礎(chǔ)上稍作修改，但他們在組胺測定時，采用流動相梯度洗滌樣液，與本實驗有很大區(qū)別；本方法的回收率在101.10%左右，檢出限為0.50 μg/mL，這完全能夠滿足組胺測定需要。

菌株J2和J4均在pH=5左右有最大組胺產(chǎn)生量，這與RODTONG等[8]研究產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes、摩根氏菌Morganella morganii和變形桿菌Proteus vulgaris的結(jié)果類似。SANTOS[9]在較早的研究發(fā)現(xiàn)中就發(fā)現(xiàn)，細菌作為自身一個防御機制，酸性條件將有利于它們產(chǎn)生組氨酸脫羧酶。

4 結(jié)語

1)建立了利用高效液相色譜內(nèi)標法測定細菌發(fā)酵液中組胺含量的方法，本方法組胺標準曲線相關(guān)相關(guān)系數(shù)和組胺回收率均較高且檢測限低，因此能夠滿足準確測定微量組胺含量的需要。

2)通過分離篩選從鰹魚內(nèi)臟中分離得到兩株產(chǎn)組胺微生物J2和J4，菌株J2和J4的最適生長溫度分別為30℃和25℃，其生物量分別達到12.67 log(CFU/mL)和12.71 log(CFU/mL)；其最適pH分別為7和6，其最大生物量分別達到10.32 log(CFU/mL)和10.39 log(CFU/mL)；菌株J2和J4產(chǎn)組胺最適溫度分別為25℃和30℃，其組胺產(chǎn)生量達到5.49 mg/L和12.47 mg/L；且在最適產(chǎn)組胺pH=5的條件下組胺產(chǎn)生量分別達到9.86 mg/L和12.02 mg/L。

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[9]SANTOS M H S.Biogenic amines:their importance in foods[J].International Journal of Food Microbiology,1996,29:213-231.