桂 玲，王 靜，祝愛珍，劉成成，劉革修

(1.湖南省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，湖南長(zhǎng)沙410006;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東廣州 510632)

最近研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中存在卵巢癌干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)［1］，且與卵巢癌發(fā)生發(fā)展及其多藥耐藥密切相關(guān)［2］。這些研究結(jié)果提示，卵巢癌干細(xì)胞是卵巢癌防治過程中重要靶細(xì)胞。

NAC-1(nucleus accumbens-1)蛋白屬于BTB/POZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員，通過BTB/POZ結(jié)構(gòu)域形成二聚體，與一些核蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)活性，參與胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性分化。在漿液性卵巢癌組織和細(xì)胞系中NAC-1表達(dá)和紫杉醇體外耐藥相關(guān)，NAC-1通過部分抑制Gadd45gip1的表達(dá)、負(fù)向調(diào)節(jié) Gadd45腫瘤抑制途徑的組成，包括Gadd45α及其結(jié)合蛋白Gadd45gip1，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和存活［3］。所以，本研究探究增強(qiáng)卵巢癌治療效果的輔助方法，為提高臨床卵巢癌治療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑:人卵巢癌細(xì)胞系HO8910(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，由暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生殖研究室保存);RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司);新生胎牛血清(杭州四季青生物工程科技有限公司);MTT(Sigma公司);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenⅠMix試劑盒(Tiangen公司)、MTT試劑盒、蛋白裂解液和電化學(xué)發(fā)光(electrochemilum-inescence，ECL)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);特異性siRNA和陰性對(duì)照siRNA(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.2 靶向NAC-1基因寡核苷酸的設(shè)計(jì):根據(jù)NAC-1基因的序列號(hào)NM 052876.21設(shè)計(jì)2條特異性siRNA序列:NAC-1 siRNA-1 為5'-UGACAGGCACCAACGUGUACA-3'，NAC-1 siRNA-2為5'-GAACUCGGUGCCCUUCUCCAU-3';另外設(shè)計(jì)一條陰性對(duì)照，與已知的人類基因無同源性，序列為5'-GACTT CATAAGGCGCATGC-3'。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:將人卵巢癌細(xì)胞系HO8910細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37℃培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%匯合度時(shí)，參考試劑盒說明書，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染各種siRNA(50 nmol/L)。實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照(control)組、陰性siRNA(negative siRNA)組和NAC-1 siRNAs(包括 NAC-1-siRNA-1、2)組。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔100 μL，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞0、24、48、72和96 h后，每孔加入MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，低速離心10 min棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩使沉淀充分溶解，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:細(xì)胞增殖抑制率 =(1－轉(zhuǎn)染組 A490nm/空白對(duì)照組 A490nm)×100%。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況:轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞、重懸，以3×102個(gè)/孔接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d換1次培養(yǎng)液。10 d后終止細(xì)胞培養(yǎng)，PBS清洗3次，多聚甲醛溶液固定，0.1%結(jié)晶紫染色10 min后，顯微鏡下計(jì)數(shù)含大于10個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 FCM法檢測(cè)細(xì)胞周期:用0.25%胰蛋白酶收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入1 mL70%乙醇4℃固定過夜，PBS洗滌細(xì)胞1次，重懸細(xì)胞于500 μL PBS，加入碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染色液(含RNA酶)，終濃度50 mg/L，避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)NAC-1 mRNA表達(dá):siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA、并用紫外分光光度計(jì)定量，取1 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板、NAC-1基因特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，根據(jù)2－△△Ct方法分析目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。NAC-1基因上游序列為 5'-CCAGACACTGCAGATGGAGA-3'，下游序列為5'-AAGCTGAGGATCTGCTGGAA-3'，擴(kuò)增片段為227 bp;內(nèi)參GAPDH上游序列為5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游序列為5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'，擴(kuò)增片段為219 bp。

1.8 Western印跡法檢測(cè)NAC-1蛋白表達(dá):siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白30 μg上樣，進(jìn)行12%的SDS-PAGE，120 V恒壓電泳1 h，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，含5%脫脂奶粉的TBST對(duì)膜封閉30 min，加入鼠抗人NAC-1(1∶200)或兔抗人GAPDH抗體于4 ℃孵育過夜((Sigma，Cat#G9545，1∶4 000)，次日加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗IgG(稀釋比例為1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3次。最后，ECL發(fā)光顯色，X色膠片曝光，采集圖像，采用 Gelpro4.0軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌HO8910細(xì)胞NAC-1基因表達(dá)水平的影響:轉(zhuǎn)染 NAC-1特異 siRNA的2組都能顯著沉默NAC-1基因的表達(dá)(P＜0.05)，其中，轉(zhuǎn)染NAC-1-siRNA-1后，NAC-1mRNA和蛋白表達(dá)水平最低(圖1A，B)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇NAC-1-siRNA-1進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。

2.2 NAC-1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌HO8910細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響:轉(zhuǎn)染48、72和96 h后，NAC-1-siRNA-1組 HO8910細(xì)胞增殖開始受到明顯抑制，增殖抑制率分別為(28.60±6.33)%、(39.95±7.83)%和(42.87±9.29)%(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染陰性siRNA對(duì)HO8910細(xì)胞增殖無明顯影響?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT檢測(cè)結(jié)果具有一致性，轉(zhuǎn)染NAC-1-siRNA-1后HO8910細(xì)胞的克隆集落數(shù)為(38.67±4.83)，顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組克隆集落數(shù)(89.81±5.47)和(90.24±5.65)(P＜0.05)。

2.3 NAC-1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌HO8910細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響:空白對(duì)照組與陰性siRNA組中卵巢癌HO8910細(xì)胞細(xì)胞的細(xì)胞周期分布無差異，而轉(zhuǎn)染NAC-1-siRNA-1后G1期HO8910細(xì)胞比例顯著增高(P＜0.05，圖2，表1)。

表1 NAC-1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌HO8910細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響Table 1 Effect of NAC-1 siRNA transfection on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells(±s，%，n=3)

表1 NAC-1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌HO8910細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響Table 1 Effect of NAC-1 siRNA transfection on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells(±s，%，n=3)

*P＜0.05 compared with the control group.

group G0/G1G2 S G2/M control 42.38±5.73 24.92±4.47 31.70±4.74 negative siRNA 45.68±5.95 22.45±4.60 31.87±4.66 NAC-1 siRNA-1 62.53±6.73* 12.99±3.10*24.48±3.84

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，NAC-1與胚胎干細(xì)胞的多能分化有關(guān)，調(diào)節(jié)其他多能分化因子的表達(dá)，如 Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall1 和Sall4等，參與蛋白質(zhì)間的相互作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性分化，對(duì)胚胎干細(xì)胞的多能分化是至關(guān)重要的。研究顯示，NAC-1在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括:胰腺癌、大腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌和宮頸癌。在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)化療后復(fù)發(fā)的患者體內(nèi)NAC-1表達(dá)水平明顯高于初發(fā)未治者，NAC-1表達(dá)和紫杉醇體外耐藥相關(guān)［3］;NAC-1通過部分抑制 Gadd45gip1的表達(dá)、負(fù)向調(diào)節(jié)Gadd45腫瘤抑制途徑的組成包括Gadd45α及其結(jié)合蛋白Gadd45gip1，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和存活［3］。這些資料表明，NAC-1是高度惡性的卵巢癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因。所以，通過抑制其表達(dá)、抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)活性，反轉(zhuǎn)藥物耐藥性是一個(gè)誘人的目標(biāo)。

本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將NAC-1 siRNA-1、siRNA-2分別導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)目的基因NAC-1 mRNA及其蛋白表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞的生長(zhǎng)活性明顯受到抑制，且細(xì)胞周期被阻滯于G1期，其中NAC-1 siRNA-1比siRNA-2的作用更為明顯。本研究表明，NAC-1在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活中起著非常重要的作用。推測(cè)NAC-1基因可能成為治療卵巢癌的一個(gè)新靶點(diǎn)。后續(xù)研究將深入探討利用NAC-1 siRNA-1提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性問題。

［1］Hu L，McArthur C，Jaffe RB.Ovarian cancer stem-like side-population cells are tumourigenic and chemoresistant［J］.Br J Cancer，2010，102:1276 －1283.

［2］Kobayashi Y，Seino K，Hosonuma S，et al.Side population is increased in paclitaxel-resistant ovarian cancer cell lines regardless of resistance to cisplatin［J］.Gynecol Oncol，2011，121:390－394.

［3］Ishibashi M，Nakayama K，Yeasmin S，et al.A BTB/POZ gene，NAC-1，a tumor recurrence-associated gene，as a potential target for Taxol resistance in ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2008，14:3149－3155.