鄧 芳，郭海英，支 軼，連小華，楊 恬*

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物教研室;2.西南醫(yī)院全軍泌尿外科研究所，重慶 400038)

白發(fā)是人和哺乳動(dòng)物衰老的一個(gè)明顯體征，了解其形成的原因?qū)?duì)了解衰老的機(jī)制提供理論依據(jù)。毛發(fā)具有周期性生長(zhǎng)的特性［1］，其毛干結(jié)構(gòu)的更替伴隨著周期性的色素形成［2－3］。黑色素譜系細(xì)胞周期性的激活、分化、增殖、遷移及合成、呈遞黑色素給角質(zhì)化細(xì)胞是毛發(fā)周期性色素形成的基礎(chǔ)［3－4］。然而，毛囊黑色素譜系細(xì)胞的這種周期性功能并不能一直良好地維持下去，隨著年齡的增長(zhǎng)，會(huì)逐漸出現(xiàn)不可逆的毛發(fā)變白。

在關(guān)于衰老機(jī)制的研究中，人們發(fā)現(xiàn)許多組織器官如骨、骨骼肌、血管等的衰老性變化都與經(jīng)典Wnt-β-catenin 信號(hào)通路的變化相關(guān)［5－7］。前期研究也提示β-catenin能促進(jìn)毛囊黑素譜系細(xì)胞的分化［5－7］，其周期性的特征性的表達(dá)變化可能是毛發(fā)周期性色素生成的重要基礎(chǔ)。據(jù)此推測(cè)在正常老年機(jī)體的皮膚組織出現(xiàn)了經(jīng)典Wnt-β-catenin信號(hào)通路的改變，從而影響了毛囊黑素譜系細(xì)胞的周期性行為，導(dǎo)致毛發(fā)色素形成的障礙。

本研究初步探討毛囊β-catenin在皮膚毛囊中衰老相關(guān)性變化，為進(jìn)一步探討經(jīng)典Wnt-β-catenin信號(hào)通路與衰老相關(guān)性白發(fā)的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用SPF級(jí)C57雄性小鼠［第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物所，合格證號(hào):SYXK(2007-0002)］。取出生后23 d，出生后35 d，出生后34個(gè)月C57雄性小鼠各12只，共36只。麻醉后貼皮剪短背毛后脫頸椎法處死，取其背部皮膚。出生后23 d的小鼠背皮均一地處于毛發(fā)第一周期靜止期，其背皮所取樣本在本文中用P23表示，代表年輕小鼠靜止期樣本。出生后35 d的小鼠背皮均一地處于毛發(fā)第2周期生長(zhǎng)期，其背皮所取樣本在本文中用P35表示，代表年輕小鼠生長(zhǎng)期樣本。出生后34個(gè)月小鼠背部皮膚毛發(fā)周期不同步，有區(qū)域性差異(圖1)，皮色為黑色區(qū)域?yàn)樘幱谏L(zhǎng)期的皮膚，所取樣本在本研究中用34MA表示，代表老年小鼠生長(zhǎng)期樣本。皮色為淡粉色區(qū)域?yàn)樘幱陟o止期的皮膚，所取樣本在本研究中用34MT表示，代表老年小鼠靜止期樣本。所取背部皮膚標(biāo)本分為3個(gè)部分:1)4%多聚甲醛4℃固定12 h備用于石蠟包埋切片;2)－80℃保存?zhèn)溆糜诘鞍滋崛?3)保存于液氮罐中備用于RNA提取。

圖1 34月齡C57小鼠毛發(fā)與皮膚肉眼觀察大體情況Fig 1 Hair and skin appearance of 34 months old C57 mouse 3

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR方法檢測(cè)比較老齡鼠、年輕鼠皮膚中β-catenin mRNA在毛囊周期中的表達(dá):取 P23、P35、出生后34個(gè)月C57雄性小鼠生長(zhǎng)期區(qū)域皮膚和靜止期區(qū)域皮膚組織各100 mg左右，DEPC水清洗組織3遍。采用 Trizol、氯仿/異丙醇法進(jìn)行總RNA的提取。分光光度儀中檢測(cè)RNA純度及濃度。根據(jù)Genebank中CD1小鼠β-catenin序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，同時(shí)以看家基因GAPDH作為內(nèi)參，序列如下:β-catenin上游引物為5'-ATCACTGAGCCTGCCATCTG-3'，下游引物為5'-GTTGCCACGCCTTCATTCC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為581 bp GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度450 bp。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后PCR。PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)結(jié)果并照相，使用Quantity one軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析計(jì)算，測(cè)定各條帶的吸光度值，以β-catenin條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值表示β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.2 Western blot方法檢測(cè)比較老齡鼠、年輕鼠皮膚中 β-catenin蛋白在毛囊周期中的表達(dá):取P23、P35、出生后34個(gè)月C57雄性小鼠生長(zhǎng)期區(qū)域皮膚和靜止期區(qū)域皮膚組織各100 mg左右，液氮中研磨提取總蛋白。BCA法測(cè)蛋白濃度。常規(guī)Western blot操作。一抗:小鼠抗小鼠β-catenin單克隆一抗，空白對(duì)照用小鼠抗小鼠GAPDH單克隆一抗。HRP化學(xué)發(fā)光法顯色。獲得圖像后用Quantity one軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析計(jì)算，測(cè)定各條帶吸光度值，以β-catenin條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值表示β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.3 石蠟包埋切片，IF檢測(cè)比較老齡鼠、年輕鼠皮膚毛囊中β-catenin蛋白在毛囊周期中的表達(dá):取P23、P35、出生后34個(gè)月C57雄性小鼠生長(zhǎng)期區(qū)域皮膚和靜止期區(qū)域皮膚組織修剪為約8 mm×5 mm長(zhǎng)方形皮片，石蠟切片。常規(guī)免疫熒光操作。一抗:小鼠抗小鼠β-catenin單克隆一抗，另以PBS代替一抗做空白對(duì)照。二抗:Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體。熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Quantity One采集RT-PCR與WB圖片條帶吸光度，用SPSS10.0對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析，最后相對(duì)表達(dá)量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)皮膚β-catenin mRNA在毛囊周期中的表達(dá)

C57小鼠背皮的β-catenin mRNA的表達(dá)由強(qiáng)到弱的順序?yàn)?34MA、P35、34MT、P23?？梢?β-catenin mRNA在老齡鼠生長(zhǎng)期的表達(dá)強(qiáng)于在年輕鼠生長(zhǎng)期的表達(dá)。在老齡鼠靜止期的表達(dá)也強(qiáng)于在年輕鼠靜止期的表達(dá)。(P＜0.05)(圖2，表1)。

圖2 β-catenin mRNA在小鼠毛囊周期中的表達(dá)Fig 2 β-catenin mRNA expression in hair cycle in mice skin

2.2 Western blot檢測(cè)皮膚β-catenin蛋白在毛囊周期中的表達(dá)

C57小鼠背皮的β-catenin蛋白的表達(dá)由強(qiáng)到弱的順序?yàn)?34MA、P35、34MT、P23?？梢?β-catenin蛋白在老齡鼠生長(zhǎng)期的表達(dá)強(qiáng)于在年輕鼠生長(zhǎng)期的表達(dá)。在老齡鼠靜止期的表達(dá)也強(qiáng)于在年輕鼠靜止期的表達(dá)(圖3)。上述表達(dá)變化的趨勢(shì)與RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果一致的(P＜0.05)(表1)。

圖3 β-catenin蛋白在小鼠毛囊周期中的表達(dá)Fig 3 β-catenin protein expression in hair cycle in mice skin

表1 β-catenin mRNA和蛋白在小鼠毛囊周期中表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較Table 1 Relative optical density of β-catanin mRNA and protein expression(±s，n=12)

表1 β-catenin mRNA和蛋白在小鼠毛囊周期中表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較Table 1 Relative optical density of β-catanin mRNA and protein expression(±s，n=12)

*P＜0.05 compared with 34MT;#P＜0.05 compared with 34MA.

age mRNA expression protein expression 34MT 0.4189±0.0537 0.6348±0.0241 P23 0.1235±0.0326* 0.4243±0.0378*34MA 1.0753±0.0278 0.9024±0.0167 P35 0.9204±0.0219# 0.8012±0.0184#

2.3 IF檢測(cè)比較β-catenin蛋白在年輕小鼠和老齡小鼠毛囊中的表達(dá)

通過IF檢測(cè)比較β-catenin蛋白(紅色熒光)在老齡和年輕小鼠毛囊中的表達(dá)情況:在P23和P35的小鼠皮膚，均未見β-catenin蛋白的明顯表達(dá);出生后34月齡小鼠的靜止期皮膚，β-catenin在毛囊的外根鞘和Bulge都有表達(dá)，尤其是在外根鞘上段的細(xì)胞表達(dá)明顯，膜、質(zhì)、核均有表達(dá)，在毛球部未見β-catenin的明顯表達(dá)。出生后34月齡小鼠的生長(zhǎng)期皮膚，β-catenin在毛囊的外根鞘、Bulge表達(dá)明顯，胞膜、胞質(zhì)、胞核均有表達(dá)，其中外根鞘上段的細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)，在毛球部未見β-catenin的明顯表達(dá)(圖4)。

3 討論

圖4 IF檢測(cè)β-catenin蛋白在毛囊周期中的組織學(xué)分布Fig 4 β-catenin protein distribution in hair follicles tested by IF(β-catenin red，×100)

白發(fā)是人和哺乳動(dòng)物衰老的一個(gè)明顯體征，了解其形成的原因?qū)?duì)人們理解衰老的機(jī)制，治療衰老相關(guān)性疾病提供一些理論基礎(chǔ)。年輕機(jī)體正常的毛囊中，黑色素譜系細(xì)胞周期性的激活、分化、增殖、遷移、合成及遞呈黑色素給角質(zhì)化細(xì)胞是毛發(fā)周期性色素形成的基礎(chǔ)［8］。隨著年齡的增長(zhǎng)，這一過程中某些環(huán)節(jié)的障礙可能是衰老性白發(fā)產(chǎn)生的原因?；谝延械挠嘘P(guān)衰老的研究中，許多證據(jù)提示衰老與經(jīng)典 Wnt-β-catenin 信號(hào)通路的變化相關(guān)［5，7，9］，并且前期研究也指明β-catenin能促進(jìn)毛囊黑素譜系細(xì)胞的分化，其周期性的表達(dá)變化可能是毛發(fā)周期性色素生成的重要基礎(chǔ)［10－11］，據(jù)此推測(cè)在正常老年機(jī)體的皮膚組織有經(jīng)典Wnt-β-catenin信號(hào)通路的改變，從而影響了毛囊黑素譜系細(xì)胞的周期性行為，導(dǎo)致毛發(fā)色素形成的障礙。

研究C57年輕鼠和鼠齡34個(gè)月的老年鼠，檢測(cè)比較了皮膚毛囊的β-catenin mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平、蛋白表達(dá)在毛囊中的組織學(xué)分布3個(gè)方面的差異。不論是在mRNA水平，還是在蛋白質(zhì)水平，相較于處于同一毛囊周期階段的年輕鼠皮膚，老年鼠背皮的β-catenin表達(dá)均有上調(diào)。但老年小鼠毛囊β-catenin的表達(dá)在靜止期和生長(zhǎng)期都是增強(qiáng)的，且集中在外根鞘和Bulge細(xì)胞，也可以觀察到β-catenin的入核現(xiàn)象，此提示在老齡小鼠毛囊中，β-catenin表達(dá)的周期性發(fā)生改變，使得MSC的周期性激活與靜息節(jié)律喪失，毛囊黑色素譜系細(xì)胞的周期性分化與色素生成不能實(shí)現(xiàn)。從表達(dá)部位上看，在老齡小鼠的毛囊中，β-catenin的表達(dá)不論在靜止期或生長(zhǎng)期，都集中于外根鞘上段和Bulge，均有入核表現(xiàn)，在外根鞘下段與毛基質(zhì)未見明顯表達(dá)，這與年輕小鼠有明顯不同［12］，提示老齡鼠毛囊中 β-catenin表達(dá)時(shí)間和部位的變化可能影響黑色素譜系細(xì)胞正常的分化及分化過程中的遷移導(dǎo)致毛發(fā)周期性色素生成障礙。綜上，在老齡小鼠毛囊中，β-catenin表達(dá)量上調(diào)，周期節(jié)律不明顯，表達(dá)部位有變化可能是衰老相關(guān)性白發(fā)產(chǎn)生的原因之一。

［1］Alonso L，F(xiàn)uch E.The hair cycle［J］.J Cell Sci，2006，119:391－393.

［2］Stenn KS，Paus R.Controls of hair follicle cycling［J］.Physiol Rev，2001，81:449 －494.

［3］Slominski A，Wortsman J，Plonka PM.Hair follicle pigmentation［J］.J Invest Dermatol，2005，124:13 －21.

［4］Osawa M，Egawa G，Mak SS.Molecular characterization of melanocyte stem cells in their niche［J］.Development，2005，132:5589 －5599.

［5］Brack AS，Conboy MJ，Roy S.Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis［J］.Science，2007，317:807 －810.

［6］Nishimura EK，Granter SR，F(xiàn)isher DE.Mechanisms of hair graying:incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche［J］.Science，2005，307:720 －724.

［7］Marchand A，Atassi F，Gaaya A.The Wnt/beta-catenin pathway is activated during advanced arterial aging in humans［J］.Aging Cell，2011，10:220 － 232.

［8］Barsh G，Cotsarelis G.How hair gets its pigment［J］.Cell，2007，130:779 －781.

［9］Chistiakov DA.How to fight with senescent cells［J］.Geriatr Gerontol Int，2011，11:233 －235.

［10］O'Connell MP，Weeraratna AT.Hear the Wnt Ror:how melanoma cells adjust to changes in Wnt［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2009，22:724 －739.

［11］Khaled M，Levy C，F(xiàn)isher DE.Control of melanocyte differentiation by a MITF-PDE4D3 homeostatic circuit［J］.Genes Dev，2010，24:2276 －2281.

［12］鄧芳，郭海英，楊恬，等.毛囊黑素譜系細(xì)胞中β-catenin在毛囊周期中的表達(dá)［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33:793－796.