王喜超，涂陽科，呂鳳巖

(天津市第一中心醫(yī)院腎內(nèi)科，天津 300192)

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)血液透析患者有血管新生［1-2］，本研究的前期中也發(fā)現(xiàn)血液透析患者血清體外可以誘導(dǎo)血管新生［3］，并且氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管新生的一個因素［4］。尿毒癥血液透析患者更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥，新生血管的喪失而導(dǎo)致的血管功能代償不全可能為其原因之一。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡［5］，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能參與了尿毒癥患者新生血管的喪失。而目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究通過體外實驗，對其進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 對象

選取天津市第一中心醫(yī)院1998年09月至2008年10月的11例維持性血液透析患者及相同時期10例健康志愿者，所有對象均簽署知情同意書。血液透析患者平均年齡(63.2±4.4)歲，原發(fā)病為慢性腎炎、高血壓腎病和多囊腎等。所有患者均用碳酸鹽透析，每周透析3次，每次4.0 h。采用二醋酸纖維素膜透析器。健康對照組平均年齡(58.3±5.1)歲，均為健康志愿者。兩組的年齡、性別組成無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 方法

1.2.1 血清的制備:透析患者在透析中動脈端采血，同時正常對照組清晨空腹采血，取血后立即低溫離心(4 000 r/min，20 min)，取上層血清 -70℃保存?zhèn)溆?。分別把透析患者血清及健康志愿者血清混合進(jìn)行實驗。

1.2.2 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組:HUVECs由重慶醫(yī)科大學(xué)組胚教研室惠贈(來源于美國ATCC公司)，內(nèi)皮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞分為實驗組和對照組，實驗組用含100 mL/L透析患者血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，對照組用含100 mL/L健康志愿者血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.2.3 形成血管樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡:把HUVECs接種于24孔培養(yǎng)板，經(jīng)上述干預(yù)30和40 h，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察血管樣結(jié)構(gòu)形成與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測內(nèi)皮細(xì)胞增殖:把HUVECs以2×103/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)前述培養(yǎng)及分組干預(yù)30和40 h后檢測，每孔加入 MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入 DMSO 150 μL，室溫震蕩10 min，在波長570 nm處用酶標(biāo)儀測量吸光度A值。每組、每個檢測點設(shè)6個復(fù)孔，重復(fù)2次，結(jié)果取均值。

1.2.5 TUNEL法檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡:把HUVECs以2×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)前述培養(yǎng)及分組干預(yù)40 h后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，再分別用3%H2O2甲醛溶液和0.1%Triton X-100封閉及通透。TUNEL反應(yīng)混合物37℃孵育1 h，酶標(biāo)熒光素抗體37℃孵育30 min，DAB顯色。400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，計數(shù)每個視野陽性細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

1.2.6 比色法檢測內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS):把HUVECs以2×106個/L密度接種于48孔培養(yǎng)板，經(jīng)前述培養(yǎng)及分組干預(yù)30和40 h后，棄上清，每孔加入200 μL蒸餾水，冰上吹打直至細(xì)胞溶解，每孔的200μL細(xì)胞裂解液按活性氧測定試劑盒(南京凱基生物)說明書檢測，最后計算各孔細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的能力。每組、每個檢測點設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)2次，結(jié)果取平均值。

1.2.7 Western blot法檢測內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3表達(dá):把HUVEC接種于50 mL培養(yǎng)瓶，經(jīng)前述培養(yǎng)及分組干預(yù)30和40 h后用PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液冰上吹打30 min，然后4℃ 12 000×g離心30 min，取上清用 BAC法進(jìn)行蛋白定量。制備100 g/L SDS-PAGE 凝膠，蛋白加樣量40 μL，100 V電壓電泳2 h分離蛋白，然后用免疫印跡系統(tǒng)(20 mA，15 h)把蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)有蛋白的膜先用血清37℃封閉1 h，然后caspase-3 1∶300稀釋的一抗(Santa Cruz)37℃孵育2 h，再用1∶1 000稀釋的相應(yīng)二抗37℃孵育1 h，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯示目的條帶，在美國Rio-Rad圖像分析系統(tǒng)中爆光成像。每一樣本重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 形成血管樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)30 h后，對照組無血管樣結(jié)構(gòu)形成;實驗組有血管樣結(jié)構(gòu)形成。培養(yǎng)到40 h后，對照組細(xì)胞數(shù)目較多，細(xì)胞生長狀態(tài)良好;實驗組形成血管樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞逐漸由長梭形變?yōu)閳A形，胞質(zhì)粗亂，細(xì)胞開始松散、脫落，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(圖1)。

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)40 h后形成的血管樣結(jié)構(gòu)開始潰解Fig 1 Vascular networks collapse after endothelial cells exposed to serum medium for 40 hours(×200)

2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測內(nèi)皮細(xì)胞增殖

實驗組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)40 h吸光度值低于對照組(P＜0.05);也低于30 h吸光度值(P＜0.05)(表1)。

2.3 TUNEL法檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)40 h后，實驗組形成血管樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞陽性染色(胞核陽性或胞質(zhì)、胞核都陽性)顯著高于對照組(P＜0.05)(圖2)。

2.4 比色法檢測內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生(ROS)

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)30和40 h實驗組內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧均高于對照組(P＜0.05)(表1)。

2.5 Western blot法檢測內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3表達(dá)

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)30 h后caspase-3表達(dá)兩組間無差異;培養(yǎng)40 h后實驗組內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3表達(dá)強(qiáng)于對照組 (P＜0.05)(表1，圖3)。

3 討論

本研究之前的研究發(fā)現(xiàn)，血液透析患者血清在體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞30 h后可以誘導(dǎo)血管新生，在本研究中的體外實驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)40 h后，實驗組內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞數(shù)量開始減少，血管樣結(jié)構(gòu)潰解，新生為血管樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而沒有形成血管樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞沒有明顯凋亡，表明血液透析患者血清在誘導(dǎo)血管新生的同時，又誘導(dǎo)了所形成血管樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而這種凋亡導(dǎo)致了新生血管的喪失。新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞為什么出現(xiàn)凋亡，推測可能與以下因素有關(guān)［6-8］，首先，內(nèi)皮細(xì)胞處于增生狀態(tài)時更容易凋亡;其次，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡是新生血管重塑的重要機(jī)制;最后，尿毒癥毒素有促內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

表1 兩組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)30和40 h后吸光度值、ROS生成及caspase-3相對內(nèi)參表達(dá)比值Table 1 Optical absorptance value(x ±s，A value，n=12)，ROS production(±s，A value，n=12)and caspase-3 expression level relative to β-actin(n=5)in two groups after endothelial cells exposed to serum medium for 30 and 40 hours

表1 兩組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)30和40 h后吸光度值、ROS生成及caspase-3相對內(nèi)參表達(dá)比值Table 1 Optical absorptance value(x ±s，A value，n=12)，ROS production(±s，A value，n=12)and caspase-3 expression level relative to β-actin(n=5)in two groups after endothelial cells exposed to serum medium for 30 and 40 hours

＊P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 30 hours.

group optical absorptance ROS production casp-3 ex urs contr 0.952±0.045 1.085±0.047 10.16±8.0 pression 30 hours 40 hours 30 hours 40 hours 30 hours 40 ho 3 10.54±8.37 0.47±0.02 0.57±0.02 trial 1.073±0.046* 0.838±0.041*# 25.08±7.86* 39.20±9.41* 0.43±0.04 0.83±0.03*

本研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)40 h，即新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時，實驗組內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生明顯多于對照組，表明ROS在血液透析患者血清促新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起作用。有研究［9］顯示，ROS在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可作為第二信使具有促細(xì)胞凋亡的作用，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶系(caspase)主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，也參與炎性反應(yīng)［10］。在本實驗中，血管樣結(jié)構(gòu)形成時內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3表達(dá)未見增加，在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)40 h時，即形成血管樣結(jié)構(gòu)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時，caspase-3表達(dá)增加，說明caspase-3是這個凋亡過程的參與者。

因血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致新生血管喪失可能進(jìn)一步激活血小板和凝血系統(tǒng)，引起炎癥反應(yīng)，加重毛細(xì)血管的塌陷及血管壁的纖維化和硬化，可能促進(jìn)了血液透析患者心血管并發(fā)癥的產(chǎn)生。

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