王 星 吳 琦 于洪志 杜鐘珍

自20世紀(jì)80年代起我國(guó)酒類(lèi)消費(fèi)急劇增加，城市居民成人飲酒率達(dá)38.8%～59.0%，飲酒相關(guān)問(wèn)題已嚴(yán)重影響我國(guó)人民的身心健康，全球近4%的死亡與乙醇有關(guān)[1]。有研究表明，乙醇與急性肺損傷、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等多種肺病有關(guān)[2]。乙醇可以引起肝、腎等臟器纖維化。本研究旨在通過(guò)觀察慢性攝入乙醇大鼠的肺組織改變，以探討乙醇和肺纖維化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠20只，160～200 g，購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)放射科研究所，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑 根據(jù)文獻(xiàn)[3]方法自行配制Lieber-Decarli乙醇飼料（Lieber-Decarli Rat Ethanol Diet）和 Lieber-Decarli對(duì)照飼料，該配方飼料含熱量4 185.85 J/mL。其中乙醇飼料熱量：35%來(lái)自脂肪，11%碳水化合物，18%蛋白，36%乙醇；對(duì)照飼料熱量：35%來(lái)自脂肪，47%碳水化合物，18%蛋白。大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。Masson三色染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物分組、模型的建立及標(biāo)本處理 將20只大鼠按體質(zhì)量編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成乙醇組和對(duì)照組，每組10只。對(duì)照組每日給定量Lieber-Decarli對(duì)照飼料單籠喂養(yǎng)；乙醇組每日給定量Lieher-Decarli乙醇飼料單籠喂養(yǎng)，不再提供飲水。16周后，將大鼠稱(chēng)質(zhì)量后經(jīng)2%水合氯醛（50 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，采用腹主動(dòng)脈放血處死動(dòng)物。沿胸骨中線(xiàn)打開(kāi)胸腔，完整分離氣管和肺組織。取右肺下葉放入10%福爾馬林溶液內(nèi)固定，行HE染色、Masson染色；右肺上葉、中葉先于液氮中保存之后一起轉(zhuǎn)存于-70℃低溫冰箱，制作組織勻漿測(cè)羥脯氨酸（HYP）、谷胱甘肽（GSH）和TIMP-1含量。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 Masson染色評(píng)定肺組織纖維化程度 用Olympus BX41光學(xué)顯微鏡，在100倍下隨機(jī)取10個(gè)視野進(jìn)行觀察，按照Szapiel法[4]肺泡炎和肺纖維化的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各視野的分值，取其平均值作為該樣本的肺泡炎和肺纖維化評(píng)估分級(jí)。

1.4.2 GSH、HYP和TIMP-1含量檢測(cè) 比色法計(jì)算大鼠肺組織中GSH和HYP的含量，通過(guò)ELISA法檢測(cè)TIMP-1含量。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料采用±s表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模前2組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），造模結(jié)束時(shí)，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量高于乙醇組（P<0.05），整個(gè)造模過(guò)程中2組大鼠總進(jìn)食量（每日進(jìn)食量×喂養(yǎng)總天數(shù)）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)好，食欲佳，鼻尖干燥，皮毛有光澤，有溏便。乙醇組大鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，易激惹，鼻尖濕紅，毛色灰暗甚至脫落，稀便等表現(xiàn)。

Table 1 Changes of total food intake and body weight in two groups表1 2組大鼠總進(jìn)食量和體質(zhì)量變化±s）

Table 1 Changes of total food intake and body weight in two groups表1 2組大鼠總進(jìn)食量和體質(zhì)量變化±s）

**P<0.01

對(duì)照組乙醇組t 10 10造模前體質(zhì)量（g）179.1±10.3 175.3±7.5 0.813造模結(jié)束時(shí)體質(zhì)量（g）260.2±4.5 180.7±6.9 7.087**總進(jìn)食量（mL）2 870±113 2 749±64 1.753組別 n

2.2 肺組織病理學(xué)改變

2.2.1 HE染色鏡下觀察 乙醇組標(biāo)本顯示部分肺組織結(jié)構(gòu)破壞、肺泡腔萎陷，肺泡間隔增寬，伴少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增生，終末細(xì)支氣管周?chē)芽梢?jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組顯示肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖 1、2。

Figure 1 The lung tissues of control group圖1 對(duì)照組肺組織（HE×100）

Figure 2 The lung tissues of alcohol group圖2 乙醇組肺組織（HE×100）

2.2.2 2組大鼠的肺泡炎和肺纖維化評(píng)分的結(jié)果 Masson染色觀察顯示乙醇組肺泡間隔中膠原纖維中度增多，融合成細(xì)帶狀；而對(duì)照組肺泡間隔偶有細(xì)絲狀膠原纖維，見(jiàn)圖3、4。 對(duì)照組與乙醇組肺泡炎評(píng)分及纖維化的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表 2。

Figure 3 The lung tissues of control group圖3 對(duì)照組肺組織（Masson染色×400）

Figure 4 The lung tissues of alcohol group圖4 乙醇組肺組織（Masson染色×400）

2.3 2組肺組織勻漿中HYP、GSH和TIMP-1含量的比較 乙醇組肺組織勻漿HYP和TIMP-1含量高于對(duì)照組，GSH含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或 P<0.01），見(jiàn)表 2。

Table 2 Comparison of indexes between two groups表2 2組各檢測(cè)指標(biāo)比較±s）

Table 2 Comparison of indexes between two groups表2 2組各檢測(cè)指標(biāo)比較±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別對(duì)照組乙醇組t n 10 10肺泡炎（分）1.23±0.11 2.47±0.19 12.691**肺纖維化（分）1.29±0.16 2.39±0.22 10.869**HYP（mg/g）0.343±0.073 0.579±0.134 3.128*GSH（mg/g）0.301±0.076 0.067±0.037 2.742*TIMP-1（μg/L）1 107.04±236.73 1 921.42±331.82 4.29**

3 討論

肺纖維化是由于過(guò)多的成纖維細(xì)胞聚集和細(xì)胞外的基質(zhì)成分如膠原蛋白沉積而導(dǎo)致正常的肺組織結(jié)構(gòu)改變和功能喪失的一類(lèi)疾病。雖然起因不同，但纖維化的發(fā)展與結(jié)局基本相似。研究表明，氧化應(yīng)激在彌漫性肺疾?。ㄓ绕涫欠卫w維化）的發(fā)病中具有重要的作用，增加氧化劑的水平或者降低抗氧化能力能促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)展，不同類(lèi)型的氧化應(yīng)激可能引起不同特征的彌漫性肺疾病[5]。肺泡上皮細(xì)胞襯液和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)的GSH是肺部主要的抗氧化物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，乙醇組肺組織內(nèi)GSH含量要明顯低于對(duì)照組，表明慢性乙醇可以使肺內(nèi)GSH產(chǎn)生減少，進(jìn)而可能引起氧化/抗氧化失衡，造成肺損傷。同時(shí)病理結(jié)果顯示乙醇組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，肺泡間隔內(nèi)膠原纖維沉積明顯增多，提示飲酒可以對(duì)大鼠肺組織造成損傷并引起肺間質(zhì)改變和纖維化。

肺纖維化發(fā)病機(jī)制的共同特征可能是體內(nèi)膠原代謝的失衡，即膠原合成超過(guò)破壞，或膠原合成增加或(和)膠原破壞減少而導(dǎo)致膠原過(guò)多地沉積在肺實(shí)質(zhì)內(nèi)。由于HYP為膠原纖維所特有，故可作為評(píng)價(jià)肺纖維化的指標(biāo)。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積是肺纖維化的主要特征，許多酶可以降解ECM成分中大分子蛋白質(zhì)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）被認(rèn)為是最重要的一類(lèi)。ECM與MMPs之間的失衡或MMPs與TIMPs之間的失衡均可導(dǎo)致ECM的代謝失衡。因此，MMPs/TIMPs在肺損傷及肺纖維化過(guò)程中可能發(fā)揮了重要的作用[6]。TIMP-1幾乎能夠抑制所有已知MMPs的活性，從而在維持生理狀態(tài)下ECM的沉積、降解平衡中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性飲酒大鼠的肺組織勻漿HYP和TIMP-1含量明顯高于對(duì)照組，提示高水平表達(dá)的TIMP-1可能抑制了MMPs的活性，使Ecm在肺損傷修復(fù)過(guò)程中合成增加，降解減少，膠原代謝紊亂，導(dǎo)致肺組織HYP含量增加，從而發(fā)生了纖維化改變。這也提示TIMP-1的增高可能是慢性飲酒大鼠肺間質(zhì)膠原沉積的主要原因。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β是肺、腎、肝及皮膚病理性纖維化增生中的關(guān)鍵因子，TGF-β1在肺成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)TIMP-1，引起不可逆的肺纖維化，常被稱(chēng)為“纖維化損傷性修復(fù)”[7]。已有研究顯示，慢性飲酒大鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)升高[8]。本研究顯示慢性飲酒大鼠肺組織中TIMP-1表達(dá)升高，提示二者在慢性飲酒導(dǎo)致肺間質(zhì)改變中發(fā)揮重要作用，但二者之間的相互聯(lián)系以及更多的細(xì)胞因子在肺纖維化中的作用有待進(jìn)一步研究。

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