梁 艷，吳雪瓊，，張俊仙，陽幼榮，李忠明

結(jié)核病(tuberculosis，TB)一直是備受關(guān)注的一個全球性健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球約有1/3 人口感染結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuerculosis，Mtb)，全世界每年都有新發(fā)結(jié)核病例830萬，死亡病例180 萬［1］。我國患結(jié)核病人數(shù)位居世界第二，每年新增結(jié)核病患者約150 萬，受感染人數(shù)約4.5 億。結(jié)核病的疫情給結(jié)核病的防治提出了新的挑戰(zhàn)，結(jié)核病的免疫治療成為研究的熱點之一，治療性疫苗的研究與開發(fā)成為一個十分重要的研究方向。在前期研究中筆者以載體CMV blue 構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌Ag 85A DNA 疫苗［2］，發(fā)現(xiàn)該疫苗對結(jié)核病具有一定的免疫治療效果。鑒于載體CMV blue 不能用于人，而采用美國FDA 建議的可用于人的質(zhì)粒載體pVAX1 重新構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌Ag 85A DNA 疫苗。本研究通過動物實驗評價pVAX1－Ag85A DNA 疫苗的免疫原性和對小鼠結(jié)核病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DNA 疫苗和菌株來源 質(zhì)粒載體pVAX1和結(jié)核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗由上海海規(guī)生物科技有限公司純化，濃度均為1 mg/ml，純度較高(A260/A280 = 2.06 ＞1.80)，幾乎不含蛋白和RNA。結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv 由中國藥品生物制品檢定所提供;微卡菌苗購自安徽龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司，規(guī)格22.5 μg/支。

1.1.2 藥物和實驗動物 利福平膠囊購自沈陽紅旗制藥有限公司，規(guī)格0.15 g;80 只6 ～8 周齡雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑盒 ELISPOT 試劑盒購自BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 疫苗的免疫原性

1.2.1.1 動物免疫分組 分為4 組，每組10 只小鼠。生理鹽水組每只小鼠肌肉注射100 μl 生理鹽水;pVAX1 載體組每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl pVAX1 載體;微卡菌苗組每只小鼠肌肉注射22.5 μg/100 μl 微卡菌苗;Ag85A DNA 疫苗組每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl Ag85A DNA 疫苗。各組小鼠每2 周肌肉注射1 次，共注射3 次。

1.2.1.2 酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT) 小鼠第3 次免疫后14 d 殺鼠取脾臟，分離脾細胞，調(diào)節(jié)脾淋巴細胞濃度為4 ×106/ml。在測試板中，分別加入培養(yǎng)液、重組Ag85A 蛋白(終濃度為5 μg/ml)、植物血凝素(PHA)(終濃度為10 μg/ml)，脾淋巴細胞為4 × 105/孔，置CO2溫箱中于37 ℃溫育48 h，用ELISPOT 方法檢測各組分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞斑點數(shù)，以各組小鼠空白對照孔為對照，計算各組小鼠檢測孔的細胞斑點數(shù)，按試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 DNA 疫苗的治療作用

1.2.2.1 小鼠結(jié)核病感染模型的制備 每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射0.4 ml 含6.8 ×104的結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv 懸液，制備結(jié)核病模型。

1.2.2.2 實驗分組 小鼠感染后，將小鼠隨機均勻地分為4 組，每組10 只小鼠。小鼠感染后第3 天開始，生理鹽水組每只小鼠肌肉注射100 μl 生理鹽水;pVAX1 載體組每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl pVAX1 載體;利福平組每只小鼠口服利福平0.02 mg/(kg·d);Ag85A DNA 疫苗組每只小鼠肌肉注射100 μg/100 μl Ag85A DNA 疫苗。各治療組每2周肌肉注射1 次，共注射3 次。

1.2.2.3 肺組織病理學(xué)檢查 在治療結(jié)束后2周，將小鼠肺右葉固定于10%中性甲醛，石蠟包埋切片，蘇木精/伊紅(HE)染色后，鏡下觀察肺組織病理改變。

1.2.2.4 肺、肝菌落計數(shù) 在治療結(jié)束后2 周，取小鼠肺左葉稱重，加生理鹽水研磨，加等體積6%NaOH 消化30 min 后，倍比稀釋取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)液上，置37℃溫箱培養(yǎng)4 周，將得到的肺左葉菌落數(shù)根據(jù)肺左葉和全肺的重量換算為全肺菌落數(shù);取部分肝稱重，加生理鹽水研磨，倍比稀釋后取100 μl 接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)液上，置37℃溫箱培養(yǎng)4 周，將得到部分肝的菌落數(shù)根據(jù)其重量和全肝的重量換算為全肝菌落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SAS6.12 軟件處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的定量資料用單因素方差分析，兩兩比較用t 檢驗;偏態(tài)分布的定量資料用秩和(Kruskal－Wallis)檢驗，兩兩比較用q(Student－Newman－Keuls)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞斑點數(shù)pVAX1 載體組和微卡菌苗組均可見少量Ag85A 特異的分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞，生理鹽水組未見;而Ag85A DNA 疫苗組可見大量Ag85A 特異的分泌IFN－γ 素的T 淋巴細胞(圖1)。與其他組相比，Ag85A DNA 疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞(S =11.832，P =0.0080)，表明Ag85A DNA 疫苗顯著增強小鼠特異的細胞免疫功能。

2.2 肺臟組織病理改變 治療結(jié)束后2 周，各治療組小鼠肺組織的鏡下病理改變見圖2。生理鹽水組肺組織病變嚴重、廣泛，實變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞顯著，肺泡壁重度腫脹、增厚，可見少量的淋巴細胞浸潤。pVAX1 載體組病變程度比生理鹽水組稍輕，肺泡壁中度、重度增厚，小部分區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)完整。利福平組無病變，肺泡結(jié)構(gòu)完整，清晰，肺泡上皮延續(xù)。Ag85A DNA 疫苗組肺組織病變較局限，以肉芽腫樣增生性病變?yōu)橹鳎?/5 區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)完整，清晰，肺泡上皮延續(xù)。病變區(qū)域出現(xiàn)典型的由類上皮細胞、多核巨細胞、泡沫樣細胞和少量淋巴細胞組成的結(jié)核肉芽腫。

圖2 各組小鼠肺組織病理結(jié)果(HE，×40)

2.3 肺、肝活菌計數(shù) 治療結(jié)束后2 周，治療組全肺菌落數(shù)由多到少依次是生理鹽水組、pVAX1 載體組、Ag85A DNA 疫苗組和利福平組，分別為(6.41 ±0.25)log、(6.16 ±0.35)log、(5.68 ±0.40)log 和(4.30 ±0.44)log。與生理鹽水組比較，pVAX1 載體組肺臟菌落數(shù)略有減少，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義;利福平組、Ag85A DNA 疫苗組肺臟菌落數(shù)分別減少2.11 log 和0.73 log(P ＜0.01)。全肝菌落數(shù)由多到少依次是生理鹽水組、pVAX1 載體組、Ag85A DNA 疫苗組和利福平組，分別為(5.53 ±0.31)log、(5.47 ±0.29 )log、(4.65 ±0.23)log 和(3.42 ±0.44 )log。與生理鹽水組比較，pVAX1 載體組肝臟菌落數(shù)略有減少，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義;利福平組、Ag85A DNA 疫苗組肝臟菌落數(shù)分別減少了2.11 log和0.88 log(P ＜0.01)。

3 討論

DNA 疫苗由能引起機體保護性免疫應(yīng)答的病原體抗原的編碼基因和載體組成，將其直接導(dǎo)入機體細胞后，并不與宿主染色體整合，而是通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達蛋白抗原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。很多研究表明DNA 疫苗可以刺激機體產(chǎn)生并長期維持所需的細胞免疫應(yīng)答，與抗結(jié)核化療相結(jié)合不僅可提高機體免疫力，而且可以提高化療效果，縮短療程［2－7］，因而可能成為結(jié)核病治療的新途徑。

Ag85A 是結(jié)核分枝桿菌和BCG 主要的分泌性蛋白，Denis［3］研究了Ag85A DNA 疫苗免疫的BALB/c 小鼠的抗原特異性CD4+和CD8+T 細胞反應(yīng)，證實Ag85A DNA 免疫疫苗可產(chǎn)生更強、更廣泛的T 細胞反應(yīng)和CTL 活性。Huygen［4］報道，用Ag85 復(fù)合物編碼基因免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生很強的細胞和體液免疫反應(yīng)，抵御活結(jié)核分枝桿菌和卡介苗的攻擊。近年來國內(nèi)外學(xué)者在結(jié)核DNA 疫苗方面進行了一系列的研究，其中在Ag85A DNA 疫苗上取得了良好的實驗效果［2－8］。因此本文在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步評價Ag85A DNA 疫苗治療小鼠結(jié)核病的療效。

IFN－γ 常被認為是抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的一個關(guān)鍵性細胞因子，也是Th1 型細胞免疫反應(yīng)的重要指標，基因免疫抗結(jié)核病的保護性效應(yīng)與分泌IFN－γ 的淋巴細胞的產(chǎn)生密切相關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，從分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞數(shù)看，與其他組比較，Ag85A DNA 疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的分泌IFN－γ 的T 淋巴細胞，表明Ag85A DNA 疫苗顯著增強小鼠特異的細胞免疫功能。從肺、肝細菌載量來看，與生理鹽水組比較，Ag85A DNA 疫苗組肺臟活菌數(shù)和肝臟活菌數(shù)均有顯著減少，分別減少了0.73 log 和0.88 log，表明Ag85A DNA 疫苗對小鼠結(jié)核病具有顯著的治療作用。但其治療作用不如利福平，其原因可能在于Ag85A DNA 疫苗是通過增強機體的細胞免疫功能間接抑制結(jié)核菌的生長，而利福平是全殺菌藥，可以直接殺滅結(jié)核菌。從肺臟病損程度和組織病變評價，與生理鹽水組和載體組病變嚴重、廣泛相比，Ag85A DNA 疫苗組肺臟病變減輕，病變局限，3/5 區(qū)域可見肺泡結(jié)構(gòu)完整，清晰，且與肺菌落計數(shù)相一致。以上研究結(jié)果表明，Ag85A DNA 疫苗對小鼠結(jié)核病具有一定的治療作用。在前期研究中，筆者用Ag85A DNA 疫苗治療小鼠耐多藥結(jié)核病模型，發(fā)現(xiàn)Ag85A DNA 疫苗對耐多藥結(jié)核病也有療效［7，8］。

綜上所述，Ag85A DNA 疫苗主要刺激Th1 型的免疫反應(yīng)，能顯著增強小鼠特異的細胞免疫功能，有望成為治療結(jié)核病新的免疫制劑，為臨床上結(jié)核病治療開辟一條新途徑。

［1］ World Health Organization. WHO report 2005－Global tuberculosis control:surveillance，lanning，F(xiàn)inancing［J］. NZMed J，2006，119(1230):1175－1176.

［2］ 吳雪瓊，張俊仙，李洪敏，等. 結(jié)核分枝桿菌Ag85A DNA 疫苗免疫治療作用的研究［J］. 中國免疫學(xué)雜志，2002，18(1):17－22.

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