杜 麗，古力巴哈爾·阿不力米提，顧 霞，郭祥萍

B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，分類繁多、復(fù)雜，診斷困難，臨床預(yù)后較差。磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)是催化環(huán)腺苷酸(c－AMP)和(或)環(huán)鳥苷酸(c－GMP)水解的蛋白酶超家族。PDE4B 對(duì)c－AMP 水解失活從而廢除c－AMP 對(duì)B 淋巴細(xì)胞的抑制作用，導(dǎo)致B 淋巴細(xì)胞過度增殖［1］。PDE4B 在炎性反應(yīng)過程中扮演重要角色，因其抑制藥具有較強(qiáng)的抗炎作用而作為藥物研究的新靶點(diǎn)［2］。BCL－2 是一種抗凋亡蛋白，在多種類型的淋巴瘤中存在高表達(dá)，認(rèn)為與預(yù)后不良有關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測B－NHL 中PDE4B 和BCL－2 的表達(dá)，探討二者在淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及對(duì)臨床診斷、分型的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院和新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2001－2007 年診斷為B－NHL 的石蠟標(biāo)本93 例，另選10 例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生做為對(duì)照。所有病例均做免疫組化CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD30、CD38、CD79α、BCL－2、BCL－6、MUM－1，按照WHO2008 年淋巴造血組織腫瘤分類方案進(jìn)行重新分類診斷［3］。

1.2 試劑 PDE4B(美國SIGMA 試劑公司);BCL－2(ZAME 試劑公司);S－P 超敏試劑盒(北京中杉試劑公司)。

1.3 方法 組織用10%中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，切厚度4 μm 切片，采用S－P 免疫組織化學(xué)染色方法，常規(guī)脫蠟至水化;枸櫞酸緩沖液(pH =6.0)中微波加熱10 min(95℃)進(jìn)行抗原修復(fù);一抗(PDE4B、BCL－2 稀釋濃度分別為1∶35，1∶50)4℃過夜，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。膽囊癌切片作為陽性對(duì)照，以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 根據(jù)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比分為:≤4%為0 分，5% ～15%為1 分，16%～30%為2 分，31% ～50%為3 分，≥51%為4 分;陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度分為:無著色或與背景均勻一致的淡黃色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。兩積分相乘，0 分為陰性(－)，1 ～4 分為弱陽性(+)，5 ～8 分為中等陽性(+ +)，9 ～12 分為強(qiáng)陽性(+ + +)［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用確切概率法，以P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDE4B 在B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤各亞型中的表達(dá) 有兩種定位表達(dá)模式:彌漫性細(xì)胞質(zhì)著色和核旁細(xì)胞質(zhì)中類似高爾基體的點(diǎn)狀著色(點(diǎn)狀著色較彌漫性著色強(qiáng)度強(qiáng))。PDE4B 在B－NHL 中表達(dá)強(qiáng)度存在差異，以LPL 最高，2 例均為強(qiáng)陽性(++)(圖1);DLBCL 陽性率為44.26%(27/61)(圖2)、LBL 為40%，3 例BL 均不表達(dá)(表1)。

2.2 BCL－2 在B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤各型中的表達(dá) BCL－2 在淋巴瘤瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞膜定位表達(dá)。在FL 中全部表達(dá);在DLBCL 陽性率為83.61%(51/61)(圖3);3 例BL 均為陰性表達(dá)(表2)。

表1 PDE4B 在B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤各型中的表達(dá)

表2 BCL－2 在B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤各型中的表達(dá)

圖3 BCL－2 在DLBCL 中的陽性表達(dá)(HE，×400)

2.3 PDE4B、BCL－2 在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá) PDE4B 在DLBCL－GCB (生發(fā)中心型)的陽性表達(dá)率為61.54%(16/26)，在DLBCL－non－GCB(非生發(fā)中心型)的陽性表達(dá)率為31.43%(11/35)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.482，P ＜0.05)。BCL－2在DLBCL－GCB 亞型中的陽性表達(dá)率為80.77%(21/26)，在DLBCL－ non－GCB 亞型中的陽性表達(dá)率85.71%(30/35)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。PDE4B 和BCL－2 在性別、民族、年齡、發(fā)病部位方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，表3)。

2.4 PDE4B 在DLBCL 不同亞型中的表達(dá)形式在GCB 和non－GCB 亞型中點(diǎn)狀表達(dá)分別為(5/16)，(5/11);彌漫表達(dá)分別為(5/16)，(3/11);兩種同時(shí)表達(dá)分別為(6/16)，(3/11)。表達(dá)形式在DLBCL－GCB 和DLBCL－non－GCB 亞型中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.594，P ＞0.05)。

圖4 PDE4B 在淋巴結(jié)反應(yīng)性增生的表達(dá)(HE，×100)

2.5 PDE4B 和BCL－2 在淋巴結(jié)反應(yīng)性增生中的表達(dá) PDE4B 在反應(yīng)性增生的濾泡生發(fā)中心吞噬細(xì)胞呈較強(qiáng)陽性表達(dá)，中心母細(xì)胞和中心細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)，套區(qū)細(xì)胞呈陰性，副皮質(zhì)區(qū)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陽性表達(dá)，并可見散在的小淋巴細(xì)胞呈陽性表達(dá)，竇組織細(xì)胞呈陽性表達(dá)(圖4)。BCL－2 在淋巴結(jié)反應(yīng)性增生中套區(qū)小淋巴細(xì)胞和副皮質(zhì)區(qū)的小淋巴細(xì)胞呈較強(qiáng)陽性表達(dá)，濾泡生發(fā)中心細(xì)胞(中心細(xì)胞和中心母細(xì)胞)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陰性。

表3 PDE4B，BCL－2 在彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)

3 討論

PDE 催化c－AMP 和c－GMP 水解開環(huán)分別生成AMP 和GMP，這是細(xì)胞內(nèi)降解c－AMP 和c－GMP 的主要途徑，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)c－AMP 水平，從而抑制c－AMP 誘導(dǎo)的凋亡［5］;同時(shí)PDE4B 選擇性刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF－α，促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖，在炎性反應(yīng)、過敏反應(yīng)中起著重要的作用，已作為藥物研究的新靶點(diǎn)［2］。Smith 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)生發(fā)中心的中心細(xì)胞和中心母細(xì)胞PDE4B 的水平很低(與本研究在反應(yīng)性增生淋巴結(jié)的表達(dá)一致)，而DLBCL－GCB 型PDE4B 的表達(dá)水平也較低。文獻(xiàn)［6］報(bào)道，對(duì)化療藥物耐藥的DLBCL 為PDE4B 高表達(dá)，高表達(dá)的PDE4B 抑制了c－AMP 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生。Adam Lerner 等［7］研究認(rèn)為PDE4B 可作為B－NHL 的治療靶點(diǎn)和判斷預(yù)后指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)中，PDE4B 在LPL、FL、MZL 中表達(dá)較高，在DLBCL、LBL、MALT 和BL 中表達(dá)較低。不同類型的淋巴瘤，PDE4B 表達(dá)變化不一，似乎與淋巴瘤侵襲性的關(guān)系不密切。病變過程呈惰性的LPL、FL、MZL，臨床上病程進(jìn)展較慢，侵襲性較弱，PDE4B表達(dá)率較高;而在惡性程度較高的LBL 中表達(dá)較低，在高度侵襲性的BL 不表達(dá)。因此，筆者認(rèn)為，PDE4B 與淋巴瘤的侵襲性可能呈負(fù)性相關(guān)，在判斷惰性淋巴瘤分期和預(yù)后方面可能具有一定意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，PDE4B 陽性表達(dá)的均為中等大小的瘤細(xì)胞，而惡性程度高、細(xì)胞增殖旺盛、核分裂明顯的大瘤細(xì)胞一般沒有表達(dá);在DLBCL－GCB 中PDE4B 表達(dá)較高于non－GCB 亞型，3 例CD5+DLBCL 全部為陰性，進(jìn)一步說明PDE4B 與淋巴瘤惡性程度和侵襲性呈負(fù)性相關(guān)。這與Smith 等［5］和Adam Lerner 等［7］的研究結(jié)果不一致。由于PDE4B 與淋巴瘤關(guān)系的研究報(bào)道較少，筆者推測其發(fā)生機(jī)制可能與cAMP 的活化和水解有不同途徑有關(guān):在non－GCB 亞型中淋巴瘤細(xì)胞c－AMP 的活化路徑可能除了PDE4B，還可能有別的成員(如PDE4A 或D等)參與［8］;而在GCB 亞型的活化路徑PDE4B 可能起著主要的作用，所以表達(dá)較高。另外，61 例DLBCL 中有23 例為維吾爾族患者，是否可能存在別的作用機(jī)制，有必要做進(jìn)一步的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，PDE4B 在淋巴瘤腫瘤細(xì)胞有兩種定位表達(dá)形式，有報(bào)道PDE4B 在鼠胚纖維母細(xì)胞內(nèi)水解c－AMP 存在不同的亞細(xì)胞定位［9］，推測兩種表達(dá)形式可能反映了PDE4B 在細(xì)胞內(nèi)功能上的變化。本研究中這兩種表達(dá)形式單獨(dú)或同時(shí)存在，在DLBCL－GCB 和non－GCB 亞型的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PDE4B 的不同表達(dá)形式是否存在功能上的差異，與腫瘤的惡性程度是否有關(guān)，尚不清。

BCL－2 也是一種原癌基因，其異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［10］。在DLBCL 中BCL－2 陽性率為83.61%，與文獻(xiàn)報(bào)道及筆者前期的研究一致［11，12］。雖然在GCB 和non－GCB 亞型中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩者表達(dá)的機(jī)制卻不同，GCB 亞型通常與t(14;18)(q32;q21)染色體易位有關(guān)，易位的BCL－2 基因位于IgH 增強(qiáng)子調(diào)控下，導(dǎo)致BCL－2 過表達(dá)。而另一種表達(dá)機(jī)制是由于BCL－2 的基因擴(kuò)增。Muris 等［13］推薦在GCB/ACB 相關(guān)CD10 和MUM1中加入BCL－2，進(jìn)行新的預(yù)后分型，認(rèn)為BCL－2可以作為DLBCL 預(yù)后的一個(gè)輔助參數(shù)。

本研究中BCL－2 在FL、LPL、MZL 表達(dá)較高(多為強(qiáng)陽性)，其中在FL 全部陽性，推測BCL－2對(duì)診斷FL 具有重要意義。但大多數(shù)低級(jí)別B 細(xì)胞性腫瘤均表達(dá)BCL－2，故不能作為淋巴瘤鑒別診斷的指標(biāo)。

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