西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（西安710004）

李妙羨 吳曉康 王香玲 耿 燕 盧 潔 王小利 張 妮 魏雅鳳

乙型肝炎病毒（HBV）為嗜肝DNA病毒，含有3200個(gè)核苷酸，其中S基因編碼合成的HBV外膜蛋由3種蛋白組成，包括主蛋白（即HBsAg），中蛋白（即HBsAg和Pre－S2蛋白）和大蛋白（即 HBsAg、Pre－S1蛋白 和 Pre－S2 蛋 白）［1］。大 蛋 白 存 在 于 感 染 顆 粒（Dane顆粒）和亞病毒管狀顆粒上，是病毒形成完整外膜的重要標(biāo)志，與病毒復(fù)制密切相關(guān)，對(duì)HBV復(fù)制過(guò)程具有反式激活作用，并與病毒顆粒從細(xì)胞內(nèi)釋放有關(guān)，乙肝病毒外膜大蛋白（HBV－LP）在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚是導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵因素，并與肝細(xì)胞毒性甚至肝癌相關(guān)［2］。近年來(lái)隨著對(duì)HBV外膜蛋白研究的深入，發(fā)現(xiàn)其有雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［3］，這是 HBVLP發(fā)揮多功能作用的依賴性結(jié)構(gòu)。通過(guò)其在乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、感染與病毒復(fù)制等方面的研究，使人們逐漸認(rèn)識(shí)到了其越來(lái)越重要的臨床意義。筆者檢測(cè)了238例 HBV－M 陽(yáng)性血清中 HBV－LP 、HBV－DNA、Pre－S1－A，并進(jìn)行了分析，探討其在臨床中的應(yīng)用。

材料和方法

1 材 料 收集2012年1月至2012年3月西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院門(mén)診及住院患者278例，其中 HBV－M 陽(yáng)性患者血清238例 （HBsAg、HBeAg、HBcAb陽(yáng)性65例；HBsAg、HBeAb、HB－cAb陽(yáng)性116例；HBsAg、HBcAb陽(yáng)性53例；HB－sAg、HBeAg、4例），男143例，女95例，年齡2～73歲，平均35.3歲；正常對(duì)照40例，男18例；女22例，年齡7～63歲，平均40.3歲，GPT、GOP、HBV－M、HBV DNA、HBV－LP及 Pre－S1－Ag均為正常。所有血清標(biāo)本均于－80℃保存。

2 方 法

2.1 HBV DNA檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）檢測(cè)，儀器為美國(guó)ABI公司7500型擴(kuò)增儀，試劑盒（YZB／國(guó)0371－2009）購(gòu)自廣州中山大學(xué)達(dá)安基因公司，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HBV DNA陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)：HBV DNA含量≥103IU／ml為陽(yáng)性。

2.2 乙型肝炎病毒Pre－S1－Ag檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫 （ELISA）技術(shù)，試劑 （YZB／國(guó)0371－2009）購(gòu)自上海阿爾法生物技術(shù)有限公司，儀器為雷杜6100型酶標(biāo)儀及3900型洗板機(jī)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Pre－S1－Ag陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：S／CO≥1為陽(yáng)性。

2.3 HBV－M檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫 （ELISA）技術(shù)，試劑盒 （YZB／國(guó)0371－2009）購(gòu)自于北京萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司，儀器為雷杜6100型酶標(biāo)儀及3900型洗板機(jī)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HBV－M陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg、HBsAb、HBeAg為S／CO≥1為陽(yáng)性；HBeAb、HBcAb為S／CO≤1為陽(yáng)性。

2.4 HBV－LP檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫 （ELISA）技術(shù)，試劑盒 （YZB／國(guó)0371－2009）為北京熱景生物技術(shù)有限公司贈(zèng)送，儀器為雷杜6100型酶標(biāo)儀及3900型洗板機(jī)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HBV－LP陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：S／CO≥1為陽(yáng)性。

以上四種試劑均在有效期內(nèi)并有試劑盒內(nèi)、外質(zhì)控（除 HBV－LP）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 HBV DNA與HBV－LP陽(yáng)性率比較：HBV DNA與HBV－LP陽(yáng)性率比較，見(jiàn)表1。238例HBVM陽(yáng)性患者血清同步檢測(cè)HBV DNA和HBV－LP，結(jié)果顯示，HBV DNA陽(yáng)性（＋）174例，陽(yáng)性率為73.11%（174／238）；HBV－LP陽(yáng)性（＋）198例，陽(yáng)性率為83.19%（198／238）。以 HBV DNA 和 HBV－LP為判斷病毒復(fù)制指標(biāo)，有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 HBV DNA與HBV－LP檢測(cè)結(jié)果

2 Pre－S1－Ag與 HBV－LP陽(yáng)性率比較：Pre－S1－Ag與HBV－LP陽(yáng)性率比較，見(jiàn)表2。238例 HBV－M陽(yáng)性患者血清同步檢測(cè)Pre－S1－Ag和 HBV－LP，結(jié)果顯示，HBV－LP陽(yáng)性（＋）198例，陽(yáng)性率為83.19%（198／238）；Pre－S1－Ag1陽(yáng) 性 （＋ ）184 例，陽(yáng) 性 率 為77.31%（184／238）；二者有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 Pre－S1－Ag與 HBV－LP檢測(cè)結(jié)果

3 HBV標(biāo)志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率比較：HBV標(biāo)志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率，見(jiàn)表3。238例HBV－M陽(yáng)性患者血清同步檢測(cè)HBV標(biāo)志物、HBV DNA和HBV－LP，結(jié)果顯示，65例HBsAg、HBeAg、HBcAb陽(yáng)性（＋）標(biāo)本中 HBV DNA，陽(yáng)性率為95.4%（62／65），HBV－LP陽(yáng)性率為96.9%（63／65）；116例 HBsAg、HBeAb 、HBcAb陽(yáng)性（＋）標(biāo)本中HBV DNA陽(yáng)性率為67.0%（80／116），HBV－LP陽(yáng)性率為75.9%（88／116）；4例HBsAg、HBeAg陽(yáng)性（＋）標(biāo)本中HBV DNA陽(yáng)性率為100.0%（4／4），HBV－LP陽(yáng)性率為100.0%（4／4）；以上三種模式，HBV DNA與HBV－LP的陽(yáng)性率比較無(wú)顯著性差異（P﹥0.05）；53例 HBsAg、HBcAb陽(yáng)性（＋）標(biāo)本中 HBV DNA 陽(yáng)性率為52.8%（28／53），HBV－LP陽(yáng)性率為84.9%（45／53），二者比較有顯著性差異（P＜0.05）。

4 正常對(duì)照40例，GPT、GOP、HBV－M、HBV DNA、Pre－S1－Ag及 HBV－LP檢測(cè)均為陰性。

表3 HBV標(biāo)志物不同模式HBV DNA與HBV－LP檢出率比較

討 論

乙型肝炎具有較強(qiáng)傳染性，且病后發(fā)生肝硬化、肝癌的相對(duì)危險(xiǎn)度增高［4］，對(duì)患者生活、健康等造成嚴(yán)重影響，因此如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段對(duì)乙肝的診斷、抗病毒治療、病情進(jìn)展情況及病毒復(fù)制進(jìn)行監(jiān)測(cè)評(píng)估是該病防治工作的重要一環(huán)。目前，常以外周血HBV DNA、HBeAg、Pre－S1－Ag作為臨床判斷 HBV病毒復(fù)制程度的指標(biāo)，HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果也已成為抗病毒治療效果和患者預(yù)后判斷的重要依據(jù)。但由于HBV DNA前C區(qū)nt1896位和基本核心啟動(dòng)子區(qū)（BCP）1762、1764位聯(lián)合突變導(dǎo)致 HBeAg陰性乙型肝炎、以及由核苷類藥物對(duì)HBV DNA復(fù)制的快速抑制，使患者血清中保留著低水平HBV DNA，加之，在HBV形成包膜的過(guò)程中需要大蛋白（即HBsAg、Pre－S1蛋白和Pre－S2蛋白）和中蛋白參與［5］，因此檢測(cè)Pre－S蛋白的存在對(duì)于判斷HBV復(fù)制具有一定的意義。以往檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)大蛋白的獨(dú)有片斷Pre－S1蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的［6］，但是編碼 Pre－S蛋白的 HBV－LP Pre－S區(qū)具有較復(fù)雜的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［3］，導(dǎo)致 Pre－S1－Ag的檢出率低［7，8］不能很好反映HBV的復(fù)制情況?；谝陨显?，可能造成假陰性結(jié)果，該研究也證明了這一點(diǎn)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于乙型肝炎病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)的大量研究證明，HBV－LP主要存在于不含核酸的亞病毒顆粒以及完整的乙型肝炎病毒顆粒，且與乙型肝炎病毒的復(fù)制有著密切的關(guān)系，能在一定程度上反映乙型肝炎病毒復(fù)制情況［9］，病毒復(fù)制期HBV－LP大量滯留在肝細(xì)胞中，對(duì)肝細(xì)胞有直接的毒性作用，且對(duì)HBV復(fù)制的過(guò)程具有反式激活作用，并與病毒顆粒從細(xì)胞內(nèi)釋放調(diào)節(jié)有關(guān)［2］，有研究表明在治療應(yīng)答過(guò)程中HBV－LP比HBV DNA陰轉(zhuǎn)大約5個(gè)月，在不同的個(gè)體可能時(shí)間不一樣［10］，所以 HBV－LP的檢測(cè)對(duì)乙型肝炎的診斷、治療效果的觀察以及是否治療徹底有非常重要。

本研究我們通過(guò)對(duì)患者血清中HBV－LP、HBV DNA、HBV－M 及 Pre－S1－Ag進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示：HBV－LP能夠反映HBV的復(fù)制情況，血清中HBVLP含量與 HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg有著很好的相關(guān)性；且比 HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg能更好的反映HBV復(fù)制水平；HBV－LP在 HBV感染的不同模式中：HBsAg、HBeAg、HBcAb；HB－sAg、HBeAb、HBcAb；HBsAg、HBeAg；三種模式，HBV DNA與HBV－LP的陽(yáng)性率基本一致；HBsAg、HBcAb 模式HBV DNA與HBV－LP檢測(cè)陽(yáng)性率差異非常大。說(shuō)明HBV－LP在HBV感染血清中比HBV DNA、Pre－S1－Ag和 HBeAg更敏感，分析其原因：①血清HBeAg陰性結(jié)果不能說(shuō)明不存在HBV病毒復(fù)制時(shí)［11，12］，可能與長(zhǎng)期抗病毒治療導(dǎo)致基因變異造成抗原合成障礙有關(guān)；②血清HBV DNA陰性同樣不是一定表明患者體內(nèi)的HBV病毒完全清除可能是因?yàn)镠BV DNA檢測(cè)的靈敏度有限或水平較低，有研究表明血清HBV DNA水平較低時(shí)，肝臟內(nèi)仍可存在一定量的HBV DNA；③以往檢測(cè)血清HBV－LP是通過(guò)檢測(cè)其獨(dú)有片段Pre－S1－Ag來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是編碼Pre－S蛋白的 HBV－LP Pre－S區(qū)具有較復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)［3］導(dǎo)致Pre－S1－Ag檢出率較低；④HBV－LP（即 HBsAg、Pre－S1蛋白和 Pre－S2蛋白）［1］，涵蓋范圍廣檢測(cè)陽(yáng)性率高。HBV患者血清中 HBV－LP的檢測(cè)，可彌補(bǔ)HBV DNA檢測(cè)在HBV患者抗病毒治療終點(diǎn)判斷及療效評(píng)估中的不足，當(dāng)HBV患者血清中HBeAg、HBV DNA、Pre－S1－Ag陰性時(shí)，通過(guò)檢測(cè) HBV－LP可了解體內(nèi)HBV病毒復(fù)制、疾病進(jìn)展情況及抗病毒療效與預(yù)后，有效阻止病情進(jìn)一步惡化。在HBV感染者HBV DNA陰性患者的血清中檢測(cè)HBV－LP陽(yáng)性，對(duì)停藥反彈具有很好的臨床指導(dǎo)意義。

綜上所述，HBV－LP、HBV DNA、HBeAg及Pre－S1－Ag四種標(biāo)志物，從靈敏度來(lái)說(shuō)，HBV－LP（83.1%）＞Pre－S1－Ag（77.3%）＞ HBV DNA（73.1%）＞HBeAg（54.1%）。筆者認(rèn)為對(duì) HBV患者，特別是HBeAg和HBV DNA陰性患者，檢測(cè)血清中HBVLP含量對(duì)患者疾病進(jìn)展情況及抗病毒療效與預(yù)后，阻止病情進(jìn)一步惡化及對(duì)停藥反彈評(píng)估尤為重要；HBV－LP陰轉(zhuǎn)是否能作為預(yù)示抗病毒治療較為徹底有待于進(jìn)一步觀察。HBV－LP檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需特殊儀器設(shè)備，適合各級(jí)醫(yī)院推廣應(yīng)用，尤其對(duì)那些無(wú)條件開(kāi)展HBV DNA檢測(cè)單位，檢測(cè)HBV－LP就更有意義，如果條件允許同時(shí)檢測(cè)血清中HBV－M、HBV－LP、HBV－DNA 及 Pre－S1－Ag標(biāo)志物能有效降低單項(xiàng)檢測(cè)的漏檢風(fēng)險(xiǎn)。HBV－LP可作為病毒復(fù)制指標(biāo)同時(shí)也是常規(guī)檢測(cè)的一個(gè)補(bǔ)充指標(biāo)。

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