西安市第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 （西安710003） 王耀玲 王瑞娟 王亞琴

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一。卵巢位于盆腔深部，早期多無癥狀。由于缺乏有效的早期診斷方法，患者出現(xiàn)自覺癥狀時為時已晚。目前用于檢測卵巢癌的標(biāo)記物已有多種，其中糖類抗原CA－125是一種卵巢腫瘤細(xì)胞表面腫瘤相關(guān)抗原。Bast等［1］用卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株OVCA433作為抗原制備了單克隆抗體OC125，可以識別上皮性卵巢癌抗原CA125。盡管單獨(dú)檢測CA125對卵巢惡性腫瘤診斷的特異性、敏感性及準(zhǔn)確性有其局限性，CA125作為卵巢上皮性癌的診斷及病情監(jiān)測的標(biāo)志物已獲得了廣泛的應(yīng)用和肯定，已被確定作為卵巢癌患者監(jiān)測治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)的一種可靠的方法［2］。目前CA125的檢測方法有：放射免疫、酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光免疫以及電化學(xué)發(fā)光免疫等［3－5］，具有敏感、快速和穩(wěn)定的特點(diǎn)。然而，它們都需要首先對抗體進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物質(zhì)往往較昂貴、或具有放射性，而且標(biāo)記過程則不可避免地會引起抗體活性的降低。表面等離子體共振生物傳感器（SPR）是一種新興的生化檢測技術(shù)，它最顯著的特點(diǎn)是無需標(biāo)記。自從20世紀(jì)80年代Nylander等［6］和 Liedberg等［7］將其引入到氣體檢測和生物傳感器領(lǐng)域中以來，經(jīng)過20多年的發(fā)展，SPR傳感技術(shù)由于其樣品無需標(biāo)記、靈敏度高、反應(yīng)快速、可重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、藥品篩選等領(lǐng)域。本文運(yùn)用自行構(gòu)建的波長調(diào)制型SPR生物傳感器檢測卵巢癌患者血清和對照組血清中CA125抗原的表達(dá)，并與放射免疫測定結(jié)果進(jìn)行比較，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 材 料 研究對象：2009年1月至2010年12月，選擇西京醫(yī)院、陜西省人民醫(yī)院、西安市第二醫(yī)院25例病理確診為上皮性卵巢癌且CA125異?；颊哐鍢?biāo)本，20例CA125正常人群血清標(biāo)本作為對照組。主要試劑與儀器：自行構(gòu)建的Kretschmann結(jié)構(gòu)波長調(diào)制型SPR生物傳感器、OC125單克隆抗體（abcm Ltd）、3－巰基丙酸（MPA）和N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）（Alfa Aesar，USA）、N－乙基－N′（3－ 二甲氨基）丙基碳化二甲胺鹽酸（EDC）（Medpep有限公司），牛血清白蛋白（BSA）（Sigma USA），丙酮、無水乙醇、丙三醇等實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，二次去離子水，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），沖洗緩沖液（TBST，pH7.4）。

2 方 法 ①SPR生物傳感器方法特點(diǎn)：不同于目前所采用的CA125檢測方法，SPR技術(shù)無需任何標(biāo)記過程，其檢測方法是通過待測物和修飾在傳感芯片表面的特異性生物分子反應(yīng)，引起與芯片金膜接觸的介質(zhì)的介電常數(shù)的變化，從而引起表面等離子體共振波長的改變來反映特異性生物反應(yīng)過程。②感片的制作與OC125單克隆抗體的固定：將浮法玻璃基片分別用去離子水、丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗10 min，然后用氮?dú)獯蹈?。再將處理好的基片放入真空離子濺射儀中先鍍一層鉻（厚度約為2nm）以增強(qiáng)金原子的粘附力，金膜不容易脫落，鍍一層金膜（厚度為47nm）。傳感片可反復(fù)再生使用。將傳感片浸入0.1%（m／m）MPA的無水乙醇溶液中，室溫下放置12h，出后依次用無水乙醇和二次去離子水清洗以除去沒有吸附的 MPA；再將0.4mol／L的EDC溶液和0.1mol／L的NHS溶液按1∶1（v／v）的比例混合，滴于傳感片的金膜上，于35℃下放置1h后用二次去離子水洗去未鍵合的混合溶液；然后在已活化的金膜上滴上OC125單克隆抗體溶液（該溶液已用PBS緩沖液按1∶300的比例稀釋）于37℃下放置1h，用PBS緩沖液洗去未吸附的OC125單克隆抗體；最后將BSA溶液（1mg／ml）滴于金膜上，于35℃下放置40min以封閉殘余的巰基，減少非特異性吸附，然后用PBS緩沖液洗去未吸附的BSA溶液，氮?dú)獯蹈?，并將已修飾好OC125單克隆抗體的傳感片置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＂蹣悠返腟PR生物傳感器檢測：將表面已經(jīng)固定了OC125單克隆抗體的傳感片用折射率匹配液耦合在棱鏡上，在樣品池中加入100μl PBS緩沖液，記錄SPR光譜圖（圖1中曲線b），再在樣品池中加入100 μl經(jīng)1∶50稀釋的待測血清樣品，保持1h使抗體－抗原充分反應(yīng)，然后用TBST溶液沖洗傳感片，以減少非特異性吸附，再用PBS緩沖液沖洗，記錄其SPR光譜圖（圖1中曲線d），比較上述光譜圖中共振波長的移動，就可以得到抗原－抗體結(jié)合后共振波長的變化值δλ。SPR實(shí)驗(yàn)是在25℃的恒溫條件下進(jìn)行，樣品加入前后的光譜圖均以PBS緩沖液為環(huán)境液體的條件下測得。這樣可以有效地減少其他因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

結(jié) 果

1 OC125單克隆抗體的固定和抗原－抗體反應(yīng)表征 圖1所示為傳感片表面在不同狀態(tài)下的SPR圖譜。曲線a為MPA自組裝后的SPR響應(yīng)曲線。曲線b為經(jīng)過OC125單克隆抗體固定工藝后的SPR曲線。在上述固定有OC125單克隆抗體分子的傳感片表面分別通入對照組血清和卵巢癌患者血清，所測得的SPR光譜分別為曲線c和d。

圖1 MPA自組裝（a）、OC125單克隆抗體的固定（b）、對照組血清 （c）、卵巢癌患者血清（d）的SPR光譜圖

2 用SPR生物傳感器檢測樣品的CA125表達(dá)45個樣品，每個樣品測量3次取平均值并計(jì)算誤差。圖2所示為放射免疫測定結(jié)果（A）和SPR測量結(jié)果（B）。從圖2可見，SPR測量結(jié)果與放射免疫測量結(jié)果基本一致。

圖2 45個樣品的SPR檢測和放射標(biāo)記結(jié)果柱形圖

討 論

比較圖1中的SPR光譜曲線a和b的共振波長（最小值所對應(yīng)的波長位置），我們可以看到曲線b相對于曲線a有明顯的共振峰移動（δλ），說明OC125單克隆抗體分子被成功地固定于傳感片金膜表面。這是因?yàn)楣潭ㄔ诮鹉け砻娴腛C125抗體分子引起金膜表面附近介質(zhì)的折射率發(fā)生了變化，從而引起了共振峰的顯著移動。OC125抗體分子在傳感片表面的成功固定為后續(xù)CA125傳感檢測提供了保證。再比較曲線c和d相對于曲線b的共振峰移動，曲線c的共振波長相對于曲線b移動很小，δλcb為1.701nm，說明在CA125正常血清樣品中CA125表達(dá)很少。而曲線d的共振波長相對于曲線c移動較大，δλdb為18.10nm，這反映了卵巢癌患者血清中有較多的CA125抗原，它－與傳感片表面OC125抗體發(fā)生特異性反應(yīng)而結(jié)合在傳感片表面，從而引起表面折射率增加。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該SPR傳感器能很好的檢測出樣品血清中CA125抗原的表達(dá)。由圖2所示的初步試驗(yàn)結(jié)果顯示，SPR測量結(jié)果與放射免疫測量結(jié)果的變化趨勢基本一致，可以用來相對地反映血清中CA125抗原表達(dá)程度。說明了該方法應(yīng)用于CA125快速檢測的可行性。進(jìn)一步的工作還需增加采集樣本數(shù)量，從大量實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果得到SPR波長移動（δλ）與CA125抗原含量的精確關(guān)系。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用SPR生物傳感器檢測了血清中CA125抗原表達(dá)，結(jié)果顯示SPR生物傳感器能很好地檢測出樣品血清中CA125的表達(dá)差異。與化學(xué)免疫發(fā)光、放射免疫和Elisa等方法相比，SPR生物傳感器具有操作簡單、抗體無需標(biāo)記、廉價、靈敏度高、能夠快速給出檢測結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。因此SPR生物傳感器可供基層醫(yī)療單位進(jìn)行對卵巢腫瘤患者血清CA125的初步檢測。同時，由于上述優(yōu)點(diǎn)，該方法也可用于多標(biāo)志物同時檢測，為卵巢癌的早期診斷提供了可能。

［1］ Bast Jr RC，F(xiàn)eeney M，Lazarus H，et al.Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma［J］.The Journal of Clinical Investigation，1981，68 （5）：1331－1337.

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［6］ Nylander C，Liedberg B，Lind T.Gas detection by means of surface plasmons resonance［J］.Sensors and Actuators，1983，3：79－88.

［7］ Liedberg B，Nylander C，Lundstrom I.Biosensing with surface plasmons resonance－h(huán)ow it all started［J］.Biosensors and Bioelectronics，1995，10（8）：1－4.