朱森良 孫曉青

1)徐州醫(yī)學(xué)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室 徐州 221002 2)徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科 徐州 221002

前列腺癌是老年男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，以手術(shù)和內(nèi)分泌治療為主。對(duì)于晚期、復(fù)發(fā)性或激素非依賴性的患者尚無有效治療方案。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都在探求基因水平的調(diào)控方法和尋找治療新靶點(diǎn)，以期在前列腺癌的治療上取得突破。B7－H4(也稱為B7x，B7S1)是最近發(fā)現(xiàn)的B7家族負(fù)性協(xié)同刺激分子［1－3］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)B7－H4在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，可溶性B7－H4還見于腫瘤病人的血液樣本中，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后狀況存在密切關(guān)系［4－5］，因此，認(rèn)為B7－H4可能是腫瘤基因治療的分子靶點(diǎn)之一。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(PTGS)［6］。由于RNAi對(duì)基因表達(dá)的阻斷具有高效、特異性，已迅速發(fā)展成為代替基因敲除的遺傳工具。目前已廣泛應(yīng)用于泌尿系腫瘤生物治療的研究［7－9］。本研究應(yīng)用siRNA沉默人前列腺癌DU145細(xì)胞的B7－H4基因，觀察其對(duì)DU145細(xì)胞增殖凋亡的影響，為前列腺癌的基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞株(人前列腺癌DU145細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所)。(2)主要試劑:3條B7－H4 siRNA及陰性對(duì)照siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;Ham’sF12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司;(3)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime-Script RT reagent Kit)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;(4)PCR試劑盒(Taq? Version 2.0)購(gòu)自日本TaKaRa公司;(5)B7－H4和內(nèi)參照β－actin引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;(6)兔抗人B7－H4多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;(7)山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中山金橋有限公司;(8)CCK－8購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所;(9)TRNzol總RNA提取試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)和AnnexinV/PI染色試劑盒均購(gòu)自北京TIANGEN公司。

1.2 方法 細(xì)胞培養(yǎng):DU145細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的Ham’sF12培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到90%匯聚時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按細(xì)胞數(shù)3×105/孔接種細(xì)胞，每孔加入含10%FBS的Ham’sF12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)30% ～50%，棄去原培養(yǎng)液，用新無血清培養(yǎng)液輕洗2次，參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.1 siRNA 轉(zhuǎn)染:三條 B7－H4 siRNA:siRNA －1(897):Sense 5’－GCCCUUACCUGAUGCUAAATT－3’，Anti－sense 5’－UUUAGCAUCAGGUAAGGGCTT－3’;siRNA －2(446):sense 5’－GGCACCUACAAAUGUUAUATT－3’，Anti－sense 5’－UAUAACAUUUGUAGGUGCCTT－3’;siRNA －3(99):sense 5’－GGAGCAUAAUUAGCAUCAUTT－3’，Anti－sense 5’ －AUGAUGCUAAUUAUGCUCCTT－ 3’;negative control:Sense 5’－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－ 3’，Anti－sense 5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’。實(shí)驗(yàn)分5組:siRNA－1組，siRNA－2組，siRNA－3組，negative control(NC)組和空白對(duì)照組。將100 pmol siRNA用250 μL無抗生素、無血清的Ham’sF12培養(yǎng)液稀釋，輕混，室溫靜置5 min，在250 μL無抗生素、無血清Ham’sF12培養(yǎng)液中稀釋5 μL LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑，輕混，室溫靜置5 min，混合稀釋的siRNA和轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置20 min，將500 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，混勻，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%胎牛血清的Ham’s F 12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間分別收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 RT－PCR檢測(cè)B7－H4表達(dá):由GenBank檢索目的基因序列，利用Primer－BLAST在線設(shè)計(jì)引物，序列如下:B7－H4上游引物5’－CACCAGGATAACATCTCTCAGTGAA －3’，下游引物5’－TGGCTTGCAGGGTAGAATGA －3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度 120bp。同時(shí)以β－actin作為內(nèi)參照，上游引物5’－ACTCGTCATACTCCTGCT－3’，下游引物5’－GAAACTACCTTCAACTCC －3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度255bp。參照Trizol試劑說明書提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A280和A260值，計(jì)算其濃度和純度，每一樣品重復(fù)3次。利用oligo(dT)20引物和寶生物PrimeScript RT reagent Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在50 μL反應(yīng)體系中按照PCR試劑盒(Taq? Version 2.0)說明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 2min，98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，電泳攝像儀掃描記錄攝影。結(jié)果用圖象處理儀(Gene Company)分析處理。測(cè)定各個(gè)條帶的灰度值，B7－H4條帶灰度值與其相應(yīng)的β－actin條帶灰度值的比值作為各組間相互比較的參數(shù)。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)B7－H4蛋白表達(dá):收集轉(zhuǎn)染后的5組細(xì)胞，冷PBS沖洗2次后，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，冰浴30 min裂解混勻、4℃ 12 000 r/min離心5 min后，BCA法行總蛋白測(cè)定，SDS－PAGE凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗(1∶500)，4℃孵育過夜，Washing buffer洗膜后，加入二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，Washing buffer洗膜后，NBT/BCIP顯色。內(nèi)參照選用β－actin，電泳及轉(zhuǎn)膜條件同上，其他步驟相同，待NC膜晾干后掃描儀輸出結(jié)果，結(jié)果用圖象處理儀(Gene Company)分析處理。測(cè)定各個(gè)條帶的灰度值，B7－H4條帶灰度值與其相應(yīng)的β－actin條帶灰度值的比值作為各組間相互比較的參數(shù)。

1.2.4 CCK－8檢測(cè)細(xì)胞增殖:轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞胰酶消化離心，加入適量含10%FBS的Ham’sF12培養(yǎng)基后，調(diào)整其濃度為1×104/mL的單個(gè)細(xì)胞懸液，100 μL/孔的細(xì)胞懸液接種于3個(gè)96孔板，分3組:空白組、NC組和B7－H4－siRNA－3組，每組設(shè)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24 h、48 h、72 h)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔100 mL。將各組細(xì)胞放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出一塊相應(yīng)的96孔板，向每孔加入10 μL CCK－8溶液。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后取出培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(OD值)。取各孔平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率表示，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1－實(shí)驗(yàn)組平均OD值/空白對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.2.5 AnnexinV－FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡:轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用冷的PBS洗滌2次，以1×107/mL的密度重懸細(xì)胞于1×binding buffer(含Ca2+)中，取100 μL細(xì)胞于1.5 mL塑料離心管中，加入5 μL Annexin V 和10 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，輕輕混勻，避光室溫孵育15 min，每個(gè)樣品再加入400 μL 1×binding buffer，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，AnnexinV－FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。獲取的數(shù)據(jù)用AnnexinV－FITC熒光強(qiáng)度為X軸，PI熒光強(qiáng)度為Y軸的散點(diǎn)圖分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，分析方法采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)。假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)按α=0.05判定，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR法半定量檢測(cè)DU145細(xì)胞B7－H4 mRNA的表達(dá)相對(duì)量(相對(duì)于β－actin mRNA) 結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小與所設(shè)計(jì)的大小完全一致，分別為120bp和255bp。電泳結(jié)果可見siRNA－2和siRNA－3轉(zhuǎn)染組B7－H4 mRNA的表達(dá)水平有不同程度的下調(diào)，其相對(duì)量與空白對(duì)照組，NC組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中以siRNA－3轉(zhuǎn)染組下調(diào)最明顯(與siRNA －2組比，P＜0.05)，表達(dá)相對(duì)量約為 0.328 ±0.057。siRNA－1及NC組與空白對(duì)照組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1，圖1)

表1 RT－PCR檢測(cè)各組細(xì)胞B7－H4 mRNA的表達(dá)(± s，n=5)

表1 RT－PCR檢測(cè)各組細(xì)胞B7－H4 mRNA的表達(dá)(± s，n=5)

注:*P ＜0.05 vs空白組、NC 組;△P ＜0.05 vs siRNA－2

組別B7－H4 mRNA空白組0.778 ±0.091 NC 組 0.735 ±0.066 siRNA －1組 0.714±0.087 siRNA －2組 0.592±0.083*siRNA －3組 0.328±0.057＊△

圖2－1 RT－PCR檢測(cè)DU145細(xì)胞轉(zhuǎn)染各siRNA后B7－H4 mRNA表達(dá)Lane1:空白組;Lane 2:NC;Lane 3:siRNA－1;Lane 4:siRNA－2;Lane 5:siRNA－3

2.2 Western－blot檢測(cè)B7－H4蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞Western－blot檢測(cè)分析表明，內(nèi)參照β－actin為均一顯影條帶，siRNA－2和siRNA－3轉(zhuǎn)染組B7－H4蛋白的表達(dá)水平有不同程度的下調(diào)，其相對(duì)量與空白對(duì)照組及NC組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中以siRNA－3轉(zhuǎn)染組下調(diào)最明顯(與siRNA －2 組比，P ＜0.05)，表達(dá)相對(duì)量約為0.153±0.023，這與 RT－PCR結(jié)果相符合，因此確定siRNA－3為最佳干擾序列，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA－1及NC組與空白對(duì)照組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見表2、圖2)。

表2 Western－blot檢測(cè)各組細(xì)胞B7－H4蛋白的表達(dá) (±s)

表2 Western－blot檢測(cè)各組細(xì)胞B7－H4蛋白的表達(dá) (±s)

注:*P ＜0.05 vs空白組、NC 組;△P ＜0.05 vs siRNA －2組

組別 n B7－H4蛋白空白組0.618 ±0.044 NC 組 5 0.595 ±0.041 siRNA －1 組 5 0.591 ±0.037 siRNA －2 組 5 0.457 ±0.033*siRNA －3 組 5 0.253 ±0.023 5＊△

圖3－1 Western－blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA－1細(xì)胞B7－H4蛋白的表達(dá)Lane1:空白組;Lane 2:NC;Lane 3:siRNA－1;Lane 4:siRNA－2;Lane 5:siRNA－3

2.3 B7－H4基因沉默對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響 通過CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞吸光度，根據(jù)吸光度來評(píng)估DU145細(xì)胞的增殖情況實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA－3組對(duì)DU145細(xì)胞增殖生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，24 h、48 h和72 h的吸光度與空白組、NC組相比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而空白組與NC組相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表3、圖3)。轉(zhuǎn)染siRNA－3組DU145細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率24 h、48 h、72 h依次為(25.3±1.9)%、(30.6 ±2.1)%和(34.1 ±2.2)%，提示隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DU145細(xì)胞增殖受到抑制效果增加。

表3 各組DU145細(xì)胞不同時(shí)間的OD值 (±s，n=5)

表3 各組DU145細(xì)胞不同時(shí)間的OD值 (±s，n=5)

注:*P ＜0.05 vs空白組、NC 組

時(shí)間 空白組 NC組 siRNA－3組24 h 0.419 ±0.031 0.403 ±0.026 0.313 ±0.020*48 h 0.493 ±0.024 0.482 ±0.023 0.342 ±0.022*72 h 0.651 ±0.029 0.668 ±0.022 0.429 ±0.019*

圖3 各組DU145細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的OD值(±s)

2.4 干擾B7－H4對(duì)人前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀雙參數(shù)圖上，Annexin V和PI均陰性為正常，Annexin V陽性、PI陰性為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V和PI均陽性為凋亡后壞死細(xì)胞及部分壞死細(xì)胞，Annexin V陰性而PI陽性則為壞死細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h，siRNA－3組凋亡率為(28.43±1.29)%，與空白組和NC組相比凋亡率明顯增高(P＜0.05，見表4、圖4－1～圖4－3)，表明沉默 B7－H4基因的表達(dá)能促進(jìn)DU145細(xì)胞的凋亡

表4 各組DU145細(xì)胞的AnnexinV－FITC染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果 (±s)

表4 各組DU145細(xì)胞的AnnexinV－FITC染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果 (±s)

注:*P ＜0.05 vs空白組、NC 組

組別 n 凋亡率/%空白組6.52 ±0.18 NC 組 3 6.74 ±0.21 siRNA －3 組 3 28.43 ±1.29 3*

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

3 討論

機(jī)體抗腫瘤免疫主要是T介導(dǎo)的細(xì)細(xì)胞免疫。在T細(xì)胞活化和耐受的免疫調(diào)節(jié)中，B7－CD28家族成員介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞共刺激信號(hào)傳導(dǎo)途徑起著至關(guān)重要的作用。它們不僅在啟動(dòng)、增強(qiáng)和維持T細(xì)胞應(yīng)答中提供了關(guān)鍵的正性信號(hào)，而且還可提供重要的負(fù)性信號(hào)來限制、終止或削弱T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。B7家族能提供刺激或抑制信號(hào)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的反應(yīng)，這取決于B7家族哪種配體和受體作用于靶細(xì)胞［10－11］。B7－H4是最近發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員，位于人的染色體1p11.1，編碼1個(gè)具有282個(gè)氨基酸的蛋白。體外T細(xì)胞增殖試驗(yàn)證實(shí)B7－H4細(xì)胞能顯著抑制T細(xì)胞的增殖，能將T細(xì)胞阻滯在細(xì)胞增殖的G0/G1期，并降低IL－2、IL－4、IL－10和IFN－γ的分泌，尤其對(duì)IL－2更為顯著［1－12－13］。Miyatake等［14］發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中 B7 －H4 表達(dá)強(qiáng)度與浸潤(rùn)性CD3+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量呈反比，提示B7－H4可抑制T細(xì)胞向腫瘤組織中趨化，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。

B7－H4 mRNA廣泛分布于外周組織，但蛋白表達(dá)檢測(cè)陰性。說明正常外周組織B7－H4的表達(dá)在翻譯水平被嚴(yán)格調(diào)控，目前在多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞株中均檢測(cè)到B7－H4異常高表達(dá)，Chen等［15］對(duì)112例食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)患者的癌組織切片進(jìn)行B7－H4檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)B7－H4表達(dá)升高，并發(fā)現(xiàn)B7－H4表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤轉(zhuǎn)移，TNM分期正相關(guān)，與CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的密度負(fù)相關(guān)，認(rèn)為B7－H4可能是ESCC免疫治療的潛在靶點(diǎn)。Qian等［16］發(fā)現(xiàn)B7－H4在前列腺癌組織中呈彌漫性高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)，且腫瘤患者的B7－H4的表達(dá)水平隨患者腫瘤分級(jí)的增高而升高，但其與前列腺癌增殖和凋亡的關(guān)系還未見報(bào)道。

Salceda等［17］首次提出B7－H4在促進(jìn)上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起著直接的作用，首先轉(zhuǎn)染B7－H4基因到B7－H4－的人卵巢癌細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)腫瘤在SCID小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，利用siRNA下調(diào)人類乳腺癌細(xì)胞B7－H4 mRNA的表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞中caspase的活性并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究在證明所設(shè)計(jì)合成的siRNA能夠有效抑制B7－H4表達(dá)后，將這段siRNA轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞。結(jié)果顯示:在對(duì)干擾組進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，干擾組DU145細(xì)胞生長(zhǎng)增殖明顯慢于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，凋亡率明顯高于其他兩對(duì)照組。而兩個(gè)對(duì)照組之間的細(xì)胞生長(zhǎng)情況則無顯著性差異。由此可以說明B7－H4的表達(dá)與DU145細(xì)胞的生長(zhǎng)是具有相關(guān)性的。沉默B7－H4基因在一定程度上可誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。這與Salceda等的研究基本一致。B7－H4可能通過抑制T細(xì)胞活性，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視或者直接抑制腫瘤細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。然而，B7－H4在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，抑制凋亡的準(zhǔn)確作用還不是很清楚。

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