周雪 ，范志勇 ，湯煒 ，張麗萌 ，李閏婷 ，周瑜 ，崔玉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.大慶市第四中學(xué)）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一種重要的人獸共患病原菌[1]，常引起人類局部化膿感染，特別是醫(yī)院內(nèi)感染、器械植入感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，嚴(yán)重者可致敗血癥、膿毒癥等全身感染[2]；S.aureus也經(jīng)常引起動(dòng)物各種化膿性疾病，如雞的化膿性關(guān)節(jié)炎，牛、羊的急性或慢性乳房炎，豬的流產(chǎn)、皮炎，馬屬動(dòng)物的創(chuàng)傷感染、膿腫、蜂窩織炎等[3]，給人和動(dòng)物的健康帶來(lái)了巨大的危害。防治S.aureus感染的傳統(tǒng)方法是抗生素療法，但由于抗生素的濫用，耐抗生素的新菌株不斷出現(xiàn)，特別是耐甲氧西林菌株的蔓延，使得單純依靠抗生素治療S.aureus引起的相關(guān)疾病越來(lái)越無(wú)效[4-6]，因此，利用疫苗防治S.aureus感染成為了全球的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的疫苗主要有全菌滅活疫苗、莢膜多糖疫苗和內(nèi)毒素疫苗等，多年的研究證實(shí)，在臨床上的免疫保護(hù)作用并不理想[7]。近年的大量研究表明，基因工程疫苗有望成為替代傳統(tǒng)疫苗的新型疫苗，基因工程疫苗中最常見(jiàn)的是亞單位疫苗，亞單位疫苗具有針對(duì)性強(qiáng)和安全性高等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。實(shí)驗(yàn)室對(duì)S.aureus ClfA （Clumping factor A）[10]、IsdB （Iron-surface determinant B）[11]、Rap （RNAIII-activating protein）[12]和 TraP（Target of RNAIII-activiting protein）[12]蛋白進(jìn)行了大量的動(dòng)物免疫研究工作，我們發(fā)現(xiàn)ClfA、IsdA、Rap、IsdB和TraP蛋白都具有良好的免疫保護(hù)作用，小鼠免疫試驗(yàn)表明融合蛋白的免疫保護(hù)作用高于單個(gè)蛋白，但是融合蛋白的表達(dá)純化受到其大小的限制，不能有效的將更多的具有良好免疫保護(hù)作用的蛋白融合起來(lái)，近年來(lái)興起的表位疫苗能很好地解決這一問(wèn)題，它可以在不影響有效的抗原活性位點(diǎn)的前提下盡量去除免疫反應(yīng)性低的蛋白片段，而且可以避免與體內(nèi)抗原存在的交叉反應(yīng)[9]。要進(jìn)一步研究S.aureus多抗原嵌合表位疫苗，就必須對(duì)這些蛋白的抗原表位進(jìn)行研究，研究制備了抗TraP蛋白McAb的雜交瘤細(xì)胞株，為研究TraP蛋白的抗原表位奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物和質(zhì)粒

骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0和 6～8周齡 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；重組菌 Rosetta（DE3）/pET30a（+）/trap、Rosetta（DE3）/pET32a（+）/gapc、Rosetta（DE3）/pQE30/isdB、BL21（DE3）/pET32a（+）/clfA、BL21（DE3）/pET32a（+）/clfB、BL21（DE3）/pET32a（+）/can 和 BL21（DE3）/pET32a（+）/fnbpA由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 主要試劑

改良型RPMI-1640購(gòu)自Thermo公司；胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Fermentas公司；融合劑 PEG1500、DMSO、Goat anti-mouse IgGHRP、弗氏完全佐劑 （CFA）和弗氏不完全佐劑（IFA）購(gòu)自Sigma公司；Ni-NTA His-Band Resin購(gòu)自Novagen公司；單克隆抗體免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒購(gòu)自Southern Biotech公司。

1.3 抗原制備與動(dòng)物免疫

將 Rosetta（DE3）/pET30a（+）/trap 重組菌劃線接種于含有100 μg·mL-1Amp的LB平板，37℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落接種于含有100 μg·mL-1Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600nm為 0.5～0.6，加入終濃度為 100 μg·mL-1的 IPTG，誘導(dǎo)時(shí)間為3 h。取誘導(dǎo)后的菌液，離心收集菌體，并用PBS清洗3次，超聲破碎，4℃12000 rpm離心30 min，收集上清。按照Ni-NTA His-Bind Resin試劑盒說(shuō)明書純化蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用Gene Quant pro基因定量?jī)x（Amersham）測(cè)其濃度。

三次免疫劑量均為100 μg TraP蛋白/只小鼠，取純化的TraP蛋白100 μg溶解于100 μL PBS中，與等體積的弗氏佐劑充分混勻，對(duì)6～8周齡健康的BALB/c雌性小鼠進(jìn)行皮下和腹腔多點(diǎn)注射免疫，首次免疫后分別于2周和4周用同樣的方法進(jìn)行第2次和第3次免疫，初免佐劑為CFA，此后免疫佐劑均為IFA，三免后10 d尾靜脈采血，用間接ELISA方法進(jìn)行血清抗體效價(jià)測(cè)定，效價(jià)達(dá)到1∶10000以上可用于融合。在融合前3 d，按200 μg·只-1腹腔注射TraP蛋白加強(qiáng)免疫。

1.4 確立McAb ELISA檢測(cè)方法的最佳工作濃度

按段舒怡等報(bào)道的方陣滴定法進(jìn)行間接ELISA[13]。以 1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800 系列倍比稀釋抗原包被ELISA板，確定抗原的最佳稀釋度；以 1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400 系列倍比稀釋BALB/c雌性小鼠的陰、陽(yáng)性血清，確定血清的最佳工作濃度；加入1∶5000工作濃度的HRP-羊抗鼠IgG與之作用，加入底物TMB顯色，以2 M硫酸終止反應(yīng)后測(cè)定OD450nm值。P/N≥2.1判定為陽(yáng)性。

1.5 構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞株及腹水效價(jià)測(cè)定

參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版介紹的方法進(jìn)行細(xì)胞融合與選擇性培養(yǎng)。用間接ELISA方法進(jìn)行篩選，陽(yáng)性細(xì)胞用有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行克隆，三次單克隆化后擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。

選8～12周齡健康的BALB/c雌性小鼠，腹腔注射無(wú)菌的IFA 0.5 mL·只-1。一周后，將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞吹打下來(lái)，2000 r·min-1離心3 min，棄上清，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)備用。每只小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞1～3×106個(gè)。7～10 d 后，采集腹水。取少量腹水進(jìn)行間接ELISA測(cè)定效價(jià)。

1.6 McAb特異性鑒定

1.6.1 McAb亞類鑒定

按照Southernbiotech/HRP抗體亞類試劑盒操作說(shuō)明鑒定McAb的亞類。

1.6.2 交叉實(shí)驗(yàn)

采用間接ELISA的方法進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)McAb 與實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化的 ClfA、ClfB、Can、FnbA、IsdB和GapC蛋白之間的交叉反應(yīng)。

1.6.3 Western-blotting鑒定

將純化的TraP蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用濕轉(zhuǎn)化進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，以腹水McAb為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗，DAB顯色，觀察特異蛋白條帶。同時(shí)設(shè)立SP2/0細(xì)胞注射小鼠制備的腹水作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 TraP蛋白表達(dá)與純化結(jié)果

收集誘導(dǎo)后的重組菌，超聲破碎后用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白純化系統(tǒng)對(duì)TraP蛋白進(jìn)行純化，純化后測(cè)定其濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳（圖1），圖中第5道可見(jiàn)清晰的單一條帶，為純化后的TraP蛋白，顯示高純度的抗原，其分子量為23 kD，濃度為 0.557 mg·mL-1。

圖1 TraP蛋白表達(dá)與純化的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE result of expressed and purified Recombinant protein TraP

2.2 確立最佳抗原工作濃度

方陣滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗原1∶800稀釋，陰性血清和陽(yáng)性血清1∶1600稀釋時(shí)，P/N值最大，為23.21。確定間接ELISA檢測(cè)方法的最佳工作條件為抗原 1:800 稀釋（0.070 μg/孔），血清 1∶1600 稀釋。

2.3 單克隆抗體制備及效價(jià)測(cè)定

TraP蛋白免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后第7 d可見(jiàn)細(xì)胞集落，融合率約為95%，融合10 d后用建立的ELISA方法篩選，經(jīng)3次檢測(cè)和3次克隆化后，獲得11株穩(wěn)定分泌抗TraP的McAb的雜交瘤細(xì)胞，連續(xù)傳21代，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，反復(fù)凍存、復(fù)蘇后，能保持穩(wěn)定的抗體分泌能力。

用純化的TraP蛋白作為抗原，通過(guò)間接ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水抗體效價(jià)。11株McAb 的細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)在 1∶160～1∶5120 之間，而腹水抗體效價(jià)均到達(dá)1∶128000以上，明顯高于細(xì)胞培養(yǎng)上清。

2.4 McAb亞類鑒定

按照McAb亞類鑒定試劑盒操作，對(duì)11株McAb 進(jìn)行了鑒定，其中 8 株 McAb（2A1、3A6、3B1、1B4、2C5、4C7、5C3、2D8）重鏈為 IgG1 型，3 株 McAb（2A7、3A1、1C4）重鏈為 IgM 型，輕鏈均為 κ 鏈（表2）。

表1 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果Tabel 1 The result of identifiying subtypes of McAb

2.5 McAb特異性鑒定

2.5.1 交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，8株IgG1型McAb分別與ClfA、ClfB、Cna、FnbPA、IsdB 和 GapC 六種不同載體表達(dá)的蛋白反應(yīng)，OD450nm值均小于0.330。與陰陽(yáng)性對(duì)照比較，結(jié)果表明8株McAb與ClfA、ClfB、Cna、FnbPA、IsdB和GapC蛋白均無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的特異性（表2）。

表2 特異性試驗(yàn)-間接ELISA結(jié)果Table 2 Specific test of McAbs by indirect-ELISA

2.5.2 Western-blotting鑒定結(jié)果

TraP蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，以腹水初步純化后的 McAb 2A1、3A6、3B1、1B4、2C5、4C7、5C3 和 2D8為一抗，DAB顯色后，在23 kD處出現(xiàn)清晰條帶，陰性對(duì)照以SP2/0腹水為一抗，結(jié)果表明8株McAb識(shí)別的是TraP蛋白的線性表位。

圖2 單克隆抗體的Western blot鑒定Fig.2 Western blot assay of McAbs with protein TraP

3 討論

1975年Koller和Milstein創(chuàng)建了雜交瘤技術(shù)并成功制備了單克隆抗體[14]，時(shí)至今日，該法在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中依然發(fā)揮了舉足輕重的作用。與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。在制備單克隆抗體的過(guò)程中，最關(guān)鍵的步驟是細(xì)胞融合，影響融合成功的因素很多，如骨髓瘤細(xì)胞的選擇，脾細(xì)胞制備以及融合劑的選擇等。實(shí)驗(yàn)中所用的SP2/0細(xì)胞為不分泌抗體、對(duì)HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株，處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)和在對(duì)數(shù)分裂期使用是獲得高融合率的關(guān)鍵；脾細(xì)胞制備過(guò)程應(yīng)當(dāng)快速、輕柔，脾中的紅細(xì)胞會(huì)降低融合率，應(yīng)盡量去除；融合劑的分子量必須合適，分子量太小融合效率低，太大又極易引起細(xì)胞凝集，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的為PEG1500，取得了滿意的效果。實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA方法進(jìn)行篩選和有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞單克隆化，操作簡(jiǎn)單，一次可以篩選大量的樣本，并且具有較高的特異性和敏感性，能夠快速高效的獲得單克隆雜交瘤細(xì)胞株。

研究獲得了11株能夠穩(wěn)定分泌抗金黃色葡萄球菌TraP蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其中8株為IgG1型，3株為IgM型，IgM型抗體以五聚體形式作用，它是在初次免疫應(yīng)答時(shí)最早出現(xiàn)的抗體，通常僅存在于血液內(nèi)，對(duì)組織液或外分泌液中的保護(hù)作用沒(méi)有多大貢獻(xiàn)，而且純化過(guò)程較為復(fù)雜，因此，后續(xù)的工作只對(duì)8株為IgG1型單克隆抗體進(jìn)行研究。交叉試驗(yàn)中，不同表達(dá)載體表達(dá)的含有His標(biāo)簽的蛋白都不與McAb發(fā)生特異性反應(yīng)，表明這8株單克隆抗體不是針對(duì)His標(biāo)簽或者其他蛋白的，具有良好的特異性，抗體效價(jià)理想，且western-blotting結(jié)果表明這8株單克隆抗體很有可能識(shí)別的是TraP蛋白的線性表位，為進(jìn)一步利用噬菌體展示技術(shù)分析TraP蛋白的抗原表位奠定了基礎(chǔ)。

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