任 宏，龍啟才

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520;2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

自從流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)長期小劑量服用阿司匹林可以預(yù)防家族性多發(fā)性結(jié)腸息肉的癌變，就開始了非甾體類抗炎藥的抗腫瘤研究［1－4］。非甾體類抗炎藥主要是通過抑制前列腺素合成的限速酶環(huán)氧化酶的活性發(fā)揮作用。20世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶存在Ⅰ型和Ⅱ型2種同工酶［5］。選擇性環(huán)氧化酶Ⅱ型抑制劑既可以發(fā)揮非甾體類抗炎藥的抗腫瘤藥理作用［6］，又可以避免這類藥物的胃腸道相關(guān)毒副反應(yīng)，成為抗腫瘤藥物的研究熱點。鄰吡啶醌二取代衍生物(m-pyridine-quinone two replace derivatives，NJO)是由中山大學(xué)藥學(xué)院和香港科技大學(xué)聯(lián)合開發(fā)的新型選擇性環(huán)氧化酶Ⅱ型抑制劑(專利號:CN02130161.1)，本課題主要研究了NJO體內(nèi)外的抗腫瘤作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品 NJO由中山大學(xué)藥學(xué)院提供，4℃保存。NJO用DMSO溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，加藥后溶液中DMSO的終濃度＜0.25%。

1.2 細胞株 人結(jié)腸腫瘤細胞株HT-29，購自中山大學(xué)藥學(xué)院動物中心;人肺腫瘤細胞株Glc-82、人肝腫瘤細胞株Bel-7402，由中山大學(xué)腫瘤研究所惠贈;人肝腫瘤細胞株HepG2，由中山大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈。所有細胞于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，DMEM培養(yǎng)基加體積分?jǐn)?shù)5%小牛血清常規(guī)細胞培養(yǎng)。

1.3 NJO對4種腫瘤細胞株的體外抑制實驗［7］取處于指數(shù)生長期的 Bel-7402、Glc-82、HT-29、HepG2細胞，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化，吹散成均勻的單細胞懸液，200 μL接種于 96 孔板，貼壁后分別加 0.5 μL終濃度分別為 0.725、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 g·L－1的 NJO，DMSO 作為陰性對照，5.000、10.000、20.000、40.000、80.000、160.000 μmol·L－1終濃度的塞來昔布作為陽性對照。采用噻唑藍(MTT)法測定各組培養(yǎng)后OD值，取各組平均數(shù)計算存活率，公式如下:存活率=(試驗孔OD值/空白對照組OD值)×100%

1.4 透射電鏡下細胞形態(tài)觀察［8］取對數(shù)生長期的4種細胞4 mL，分別培養(yǎng)在50 mL的培養(yǎng)瓶中待細胞完全長滿。加入藥物40 g·L－1的 NJO 10 μL。放入到培養(yǎng)箱中孵育48 h后，移走培養(yǎng)基，用胰酶消化細胞并收集到離心管中，離心10 min，吸掉上清液，制成5 mL重懸細胞。將細胞團投入到含有戊二醛的透射電鏡固定液中4℃保存。用PBS洗1次后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定30 min，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋細胞制成臘塊，用超薄切片機切片，鈾鉛染色。在透射電鏡下觀測加藥后細胞內(nèi)的變化。

1.5 DNA片段電泳圖分析 取對數(shù)生長期的4種細胞4 mL，分別培養(yǎng)在50 mL的培養(yǎng)瓶中待細胞完全長滿。加入40 g·L－1藥物10 μL。放入到培養(yǎng)箱中孵育48 h后移走培養(yǎng)基，收集到離心管中，以1000 r·min－1的速率收集上清液中細胞，離心后將離心管中上清液棄掉。細胞移入EP管(1 mL)中，加入細胞裂解液(細胞裂解液含 10 mmol·L－1Tris-Hcl、1 mmol·L－1EDTA 和 2 g·L－1TritonX-100，pH 7.5)0.3 mL。細胞培養(yǎng)瓶中的細胞用冷PBS洗2次，直接加入細胞裂解液0.3 mL放入到4℃的冰箱中20 min。之后以12000 r·min－1的速率離心10 min。吸取上清液加入等體積的酚和氯仿的混合液(體積比為1∶1)，抽提1次，以12000 r·min－1的速率離心10 min取上清液。將上清液中加入300 mmol·L－1的乙酸鈉和等體積異丙醇沉淀過夜。2000 r·min－1的速率離心后收集沉淀，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗2次，干燥后加入Tris-Hcl 10 mmol· L－1、EDTA 1 mmol· L－1和0.6 g·L－1的 Rnase，在37 ℃的水浴箱中孵育30 min。樣品放到－20℃的冰箱中保存。將樣品在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠上電泳1 h，電泳采用40 mV的低電壓。溴化乙錠染色后用GDS自動照相儀器拍照，進行電泳圖像分析。

1.6 流式細胞儀分析［9］取對數(shù)生長期的HepG2細胞株用胰酶消化后，調(diào)整細胞濃度為5×105mL－1，取4 mL裝于50 mL的細胞培養(yǎng)瓶中。貼壁12 h后加入藥物 NJO 10 μL(20 g·mL－1)，陰性對照組加入等體積的DMSO溶液，陽性對照組加入20 μL的塞來昔布。每孔設(shè)有1個平行孔。分別收集加入藥物0、12、24、48 h各時間點的細胞。離心后加入0.3 mL PBS混勻，加入4℃的無水乙醇，－20℃條件下固定過夜。用PBS在常溫下洗2次，最后與1 mL的含有PI的PBS染色混勻后在4℃條件下避光放置30 min(15 mg·L－1，0.5%Tween-20，2.5 μg Rnase)，上流式細胞儀檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處的紅色熒光。

2 結(jié)果

2.1 MTT法實驗結(jié)果 結(jié)果顯示NJO可以顯著抑制 Bel-7402、Glc-82、HT-29、HepG24 種腫瘤細胞的增殖。對于 4種腫瘤細胞株的 IC50分別為 101 μmol·L－1(13.90 g·L－1)、104 μmol·L－1(14.20 g·L－1)、201 μmol· L－1(27.00 g · L－1)、140 μmol·L－1(19.00 g·L－1)。而陽性對照塞來昔布對Bel-7402、Glc-82、HT-29、HepG2 的 IC50分別為 76 μmol·L－1、73 μmol·L－1、89 μmol·L－1、98 μmol·L－1。提示NJO可能對多種腫瘤細胞株均有抑制作用。見表1。

2.2 NJO抑制腫瘤生長的機制

2.2.1 透射電鏡下觀察結(jié)果 NJO作用后誘導(dǎo)細胞凋亡早期的染色質(zhì)的變化，染色質(zhì)固縮，核皺縮，細胞整體體積變小(圖1A)。接著細胞核進一步固縮(圖1B)，聚集于核膜邊界上形成境界分明的塊狀，圍繞整個核膜環(huán)狀排列，形成凋亡所特有的環(huán)狀分布。核膜破裂，細胞核分成3～4個小核，細胞漿濃縮或裂解成質(zhì)膜包繞碎片，細胞質(zhì)中可見較完整的細胞器(如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)，細胞膜內(nèi)陷。細胞體積進一步縮小(圖1C)，最終可見凋亡小體形成(圖1D)。透射電鏡觀察結(jié)果還顯示NJO作用細胞48 h后呈現(xiàn)出凋亡不同時期的不同形態(tài)特征。提示NJO可以明顯誘導(dǎo)細胞凋亡的數(shù)量增加。

2.2.2 DNA電泳結(jié)果 NJO作用48 h后，對 Bel-7402、Glc-82、HT-29、HepG24 種細胞的 DNA 片段進行提取，DNA瓊脂糖凝膠電泳法的結(jié)果顯示電泳帶上呈現(xiàn)有等倍距離的梯狀條帶，DNA片段長度為180～200 bp之間。梯狀條帶是凋亡細胞所特有的生化特征，與壞死時的呈模糊片狀條帶差異明顯。提示NJO主要是通過誘導(dǎo)4種腫瘤細胞凋亡的途徑來達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。見圖2。

表1 NJO作用48 h時4種腫瘤細胞的存活率及其IC50

圖1 40 g·L－1NJO作用于HepG2細胞24 h后細胞形態(tài)變化

2.2.3 流式細胞儀測定結(jié)果 結(jié)果顯示給藥20 g·L－1后6 h G1峰的左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體細胞群的峰形，12 h后細胞凋亡率為27.9%。隨著時間的推移亞二倍體峰形增大，在給藥后24 h達到最大，此時的細胞凋亡率為49.7%，同時G0期峰形逐漸增大，多數(shù)細胞阻滯在G0期，細胞周期分配改變。48 h后多數(shù)細胞死亡，出現(xiàn)細胞死亡的峰形。在細胞周期中不同時期，細胞數(shù)量均有不同程度的減少，亞二倍體的細胞數(shù)量的多少不等。見圖3。

3 討論

腫瘤組織環(huán)氧化酶Ⅱ型蛋白的高表達促使人們在環(huán)氧化酶Ⅱ型抑制劑中尋找抗腫瘤藥物。NJO是新開發(fā)的選擇性環(huán)氧化酶Ⅱ型抑制劑。對環(huán)氧化酶Ⅱ型的選擇性與塞來昔布接近，選擇倍數(shù)超過300倍，而對于環(huán)氧化酶Ⅰ型的選擇性只有100倍［6］。其抗腫瘤作用值得研究。本研究采用MTT法發(fā)現(xiàn)NJO可明顯抑制4種腫瘤細胞的增殖，藥物濃度與抑制率存在一定范圍的濃度依賴性，是一種有前途的抗腫瘤藥物。同時NJO對多種腫瘤細胞增殖有抑制作用，抗瘤譜較廣，具有潛在的開發(fā)價值。在進一步探討抗腫瘤作用機制時，通過加藥后觀察腫瘤細胞形態(tài)學(xué)的變化、DNA片段瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞儀的數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NJO主要是通過阻滯腫瘤細胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的途徑來達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。提示NJO可以作為各種腫瘤的輔助治療，臨床意義重大。

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