丁雪貞，李文雅，李世朋，于 樂(lè)，謝瑞芳，張露露，周 潔，馬靈筠，席守民，2

(1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003;2.河南科技大學(xué)藥理學(xué)與醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003)

腎透明細(xì)胞癌嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，其發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全闡明。研究［1-2］表明，腫瘤細(xì)胞的遷移是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，水通道蛋白-1(aquaporin-l，AQP-1)在腫瘤毛細(xì)血管的高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng);基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在惡性腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中參與了細(xì)胞外基質(zhì)的降解和血管的生成。目前，關(guān)于AQP-1與MMP-9在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)及其臨床意義的文獻(xiàn)報(bào)道的還不太多，作者通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)AQP-1、MMP-9在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，以期探討兩者與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 所有標(biāo)本均來(lái)自河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年6月至2011年8月收集的29例腎透明細(xì)胞癌、20例正常腎臟組織標(biāo)本。所有病例均有完整臨床資料。

1.1.2 試劑 兔抗人AQP-1一抗，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗人MMP-9一抗(美國(guó)BIOSS生產(chǎn))、二步法免疫組織化學(xué)染色試劑盒(S-P-0023，美國(guó)ZYMED公司生產(chǎn))，均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;DAB顯色試劑盒(AR-0612)，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)AQP-1與MMP-9的表達(dá)所有標(biāo)本經(jīng)石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化，微波爐法抗原修復(fù)，滴加抗體，DAB顯色并顯微鏡下觀察，自來(lái)水終止，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化10 s，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 用試劑盒中的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。AQP-1:細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞;MMP-9:細(xì)胞質(zhì)和間質(zhì)中出現(xiàn)黃褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0%～10%為0分，＞10% ～25%為1分，＞25% ～50%為2分，＞50%為3分。0分為表達(dá)陰性，1～3分為表達(dá)陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

AQP-1主要表達(dá)于腎透明細(xì)胞癌組織新生毛細(xì)血管或正常腎臟組織毛細(xì)血管細(xì)胞膜，呈黃褐色;而MMP-9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和間質(zhì)中，也呈黃褐色。腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎組織中AQP-1陽(yáng)性率分別為89.7%和60.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);MMP-9的陽(yáng)性率分別為65.5%和30.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AQP-1與MMP-9在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.468，P＜0.05)。見(jiàn)表1～3。

表1 AQP-1在不同腎臟組織中的表達(dá)

表2 MMP-9在不同腎臟組織中的表達(dá)

表3 AQP-1與MMP-9在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)的關(guān)系

3 討論

3.1 AQP-1在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá) 腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)大的增殖能力，而這種增殖能力依賴(lài)腫瘤血管為其提供所需營(yíng)養(yǎng)，AQP-l在血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移中發(fā)揮著重要的作用［3-6］。AQP-1對(duì)水的高度通透性增加了毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)了水在腫瘤細(xì)胞間的快速傳遞，使腫瘤毛細(xì)血管的生成迅速，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［7］。牛文斌等［8］在研究AQP與前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性時(shí)有同樣的發(fā)現(xiàn)。本課題組前期研究［9］發(fā)現(xiàn)AQP-1在腎透明細(xì)胞癌腎小管細(xì)胞膜上表達(dá)減少，影響尿液的濃縮和稀釋功能。本文結(jié)果顯示，AQP-1在腎透明細(xì)胞癌組織新生毛細(xì)血管細(xì)胞膜上表達(dá)，且其陽(yáng)性率明顯高于正常腎臟組織，提示AQP-1可能參與了腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞膜水和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控，使腎透明細(xì)胞癌組織中毛細(xì)血管異常豐富，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3.2 MMP-9在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá) 細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要屏障，而MMP-9具有很強(qiáng)的降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到很關(guān)鍵的作用［10］。MMP-9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和間質(zhì)中，降解血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。有研究［11］發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入MMP-9抑制劑后，腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移受到抑制，其主要是通過(guò)抑制MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤血管的生成來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本文的研究也得到了同樣的結(jié)果，腎透明細(xì)胞癌組織中MMP-9的陽(yáng)性率明顯高于正常腎臟組織。

3.3 AQP-1和MMP-9在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞生存的2個(gè)必備條件。AQP-1可以促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌組織中毛細(xì)血管生長(zhǎng)，為腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)提供好的生長(zhǎng)環(huán)境;而MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，又為腫瘤細(xì)胞提供了轉(zhuǎn)移的通道。本文研究表明AQP-1和MMP-9兩者在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，這提示兩者都參與了腎透明細(xì)胞癌的發(fā)展、血管生成和轉(zhuǎn)移，并在此過(guò)程中有相互促進(jìn)作用。隨著研究的進(jìn)一步深入，AQP-1、MMP-9有望成為腎透明細(xì)胞癌診斷和基因治療的新靶點(diǎn)，為腎透明細(xì)胞癌的診斷治療提供必要的信息和參考依據(jù)。

［1］Saadoun S，Papadopoulos MC，Hara-Chikuma M，et al.Impairment of angiogenesis and cell migration by targeted aquaporin-1 gene disruption［J］.Nature，2005，434(7034):786-792.

［2］Christopoulos TA，Papageorgakopoulou N，Ravazoula P，et al.Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitors in squamous cell laryngeal carcinoma［J］.Oncol Rep，2007，18(4):855-860.

［3］Murata K，Mitsuoka K，Hirai T，et al.Structural determinants of water permeation through aquaporin-1［J］.Nature，2000，407(6804):599-605.

［4］Sui H，Han BG，Lee JK，et al.Structural basis of water-specific transport through the AQP1 water channel［J］.Nature，2001，414(6866):872-878.

［5］Kong Y，Ma J.Dynamic mechanisms of the membrane water channel aquaporin-1(AQP1) ［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98(25):14345-14349.

［6］Tajkhorshid E，Nollert P，Jensen M?，et al.Control of the selectivity of the aquaporin water channel family by global orientational tuning［J］.Science，2002，296(5567):525-530.

［7］Xiang Y，Ma B，Li T，et al.Acetazolamide suppresses tumor metastasis and related protein expression in mice bearing Lewis lung carcinoma［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23(8):745-751.

［8］牛文斌，孔祥波，魏巍.水通道蛋白與前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2006，26(11):1526-1527.

［9］李世朋，王胐胐，丁雪貞，等.AQP-1在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2012，25(1):6-8.

［10］卜宏民，王連渠，閆擁軍，等.MMP-2、MMP-9和VEGF在腎癌中的表達(dá)與臨床意義［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29(13):1595-1597.

［11］No authors listed.Combination therapy including a gelatinase inhibitor and cytotoxic agent reduces local invasion and metastasis of murine Lewis lung carcinoma［J］.Cancer Res，1996，56(4):715-718.