保志娟，周瑾艷，楊亦

（廣東省計量科學研究院，廣東 510405）

高效液相色譜法測定氨基酸口服液中L-色氨酸的不確定度評定*

保志娟，周瑾艷，楊亦

（廣東省計量科學研究院，廣東 510405）

采用高效液相色譜法測定氨基酸口服液中L-色氨酸的含量，對測量結果的不確定度進行評定。結果表明，標準曲線校準和測量重復性是測量過程中不確定度的主要來源，其中標準曲線校準對合成不確定度的影響最大。當氨基酸口服液中L-色氨酸的測定結果為8.8 μg/mL時，其擴展不確定度為1.1 μg/mL。

L-色氨酸；高效液相色譜法；氨基酸口服液；測量不確定度

色氨酸通常以游離或結合態(tài)廣泛存在于生物體中，是人類和動物必需的8種氨基酸之一。人體不能制造它，而必須從膳食中攝?。?，2］。色氨酸對生物的生長和氮平衡非常重要，色氨酸缺乏或代謝錯誤會引起一系列疾??；另一方面，色氨酸也可作為疾病的治療藥物。隨著人們對健康的重視，各種氨基酸保健食品越來越被大眾熟悉和接受。

準確測定保健食品中的色氨酸含量，對評價保健品質量、指導用戶選購意義重大。筆者利用液相色譜二極管陣列法定量測定了氨基酸口服液中L-色氨酸的含量，并根據 《化學分析中不確定度的評估指南》［3］和《測量不確定度評定與表示》［4］，對測量的不確定度進行了評定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Alliance 2675型，配2998型二極管陣列檢測器,美國Waters 公司；

L-色氨酸純度標準物質：GBW(E) 100260，純度為（99.7±0.7）%，廣東省計量科學研究院；

L-色氨酸純度標準儲備液：100 μg/mL，精密稱取約5.00 mg L-色氨酸標準品，用水溶解并準確定容至50 mL，于4℃冰箱中保存；

甲醇：色譜純；

水：超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm；

氨基酸口服液：10 mL/支，市售。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；檢測波長：280 nm；流動相：甲醇(A)–水(B)；梯度洗脫程序：流動相A初始值體積分數為30%（保持2 min），2～10 min內A體積分數由30%變化為70%，10～14 min，A體積分數由70%變化至40%，14～15 min，B由體積分數40%變化至30%；流速：1.0 mL/min。環(huán)境溫度：(20±5)℃；相對濕度：不大于70%。

1.3 實驗步驟

取市售氨基酸口服液1支，搖勻，準確移取1.0 mL，置于10 mL容量瓶中定容，用0.45μm濾膜過濾，上機測試，用外標曲線法定量。

2 測量不確定度來源

高效液相色譜法測定氨基酸口服液中L-色氨酸含量的不確定度主要來源：L-色氨酸純度標準儲備液的配制、標準曲線校準、樣品處理、色譜峰面積測量及重復性測量。

3 數學模型

氨基酸口服液中L-色氨酸的濃度可表示為：

式中：csp——樣品溶液中L-色氨酸的質量濃度，μg/mL；

Ax——樣品溶液中L-色氨酸的色譜峰面積，μV·s；

c0——標準工作液中L-色氨酸的質量體積濃

度，μg/mL；

Vsp——氨基酸口服液的定容體積，mL；

A0——標準工作液中L-色氨酸的色譜峰面積，μV·s；

4 測量不確定度評估［3，4］

4.1 標準曲線校準引入的不確定度

分別取50，100，300，500 μL及1.0，2.0 mL的L-色氨酸標準溶液，用水定容，搖勻，配制成不同濃度的標準工作液，按1.2儀器工作條件進行分析。

對以上6種濃度的L-色氨酸系列標準溶液分別測定6次，得到相應的峰面積，并計算峰面積平均值，測定結果列于表1。

表1 系列標準溶液的色譜峰面積

用最小二乘法擬合標準溶液濃度–峰面積校準曲線，得線性回歸方程A=14 055.9c –2 751.99 ，相關系數r =0.999 94。在標準工作溶液中，L-色氨酸的濃度為c0時測量所產生的不確定度u(c0)為：

式中：s——標準溶液峰面積殘差的標準偏差；

b1——校準曲線的斜率；

p——被測樣品的測量次數，p=6；

n——6種標準溶液總測試次數，n =36；

c0——L-色氨酸樣品溶液對應于標準工作曲線的濃度，c0=0.880 109 μg/mL；

Ai——標準溶液色譜峰面積；

ci——標準溶液的濃度，μg/mL。

將表1中的數據代入式（2）、式（3）計算求得u(c0)=0.051 98 μg/mL。

標準溶液中L-色氨酸的質量體積濃度c0的不確定度僅與峰面積不確定度有關，而與標準溶液不確定度無關，也不與從同一溶液中逐次稀釋產生必然的相關性［3］，故標準貯備液稀釋成標準溶液所產生的不確定度可以忽略,urel(c0)=u(c0)/c0=0.059 06。

4.2 L-色氨酸標準儲備液濃度引入的不確定度

（1）L-色氨酸標準物質純度引入的不確定度

L-色氨酸標準物質證書標示的純度P為（99.7±0.7）%，取容量因子k=2，則L-色氨酸標準物質純度引入的標準不確定度u(P)=0.007/k =3.5×10–3，urel(P)=u(P)/P=3.51×10–3。

（2）標準物質稱量引入的不確定度

檢定證書給出了天平的最大允許誤差為±0.01 mg。標準不確定度分量應重復計算兩次，一次是空盤，另一次為毛重，因為每一次稱量均為獨立的觀測結果。實驗實際稱取標準物質5.02 mg,由此得到標準物質稱量引入的標準不確定度u(m)=0.008 2 mg，則urel(m)=0.008 2/5.02=1.633×10–3。

（3）標準儲備溶液定容體積引入的不確定度

標準儲備液定容使用50 mL單標線A級容量瓶，定容體積引入的不確定度u(V)由以下兩項合成得到：

①容量瓶的體積引入的不確定度u1(V)。檢定證書給定容量允差為±0.05 mL，按照矩形分布計算，不確定度分量= 0.028 87（mL）。

②實驗溫度波動引入的容量瓶體積不確定度u2(V)。實驗室的溫度波動范圍為±5℃，水的熱膨脹系數為2.1×10–4/℃，按矩形分布計算，=0.030 3（mL）。

合并以上兩項，得標準儲備溶液定容體積引入的不確定度：

L-色氨酸標準儲備液濃度引入的相對標準不確定度urel(S)可由urel(P)，urel(m)，urel(V) 3項合成而得：

4.3 樣品處理引入的不確定度

移液管和容量瓶定容不確定度來源：排出或定容體積的重復性、體積校準時的不確定度以及由實驗室溫度與取樣器皿校準時溫度不一致而帶來的不確定度，其中排出或定容體積的重復性歸入整個測試程序統(tǒng)一考慮。

體積校準不確定度：取樣采用1 mL的A級移液管，定容時采用10 mL的A級容量瓶。按照檢定規(guī)程JJG 196–2006要求，1 mL移液管的最大允許誤差為0.008 mL，10 mL容量瓶的最大允許誤差為0.02 mL，近似為矩形分布。則移液管的標準不確定度為（mL），容量瓶的標準不確定度為=0.011 5 mL。

溫度引入的不確定度：實驗室的實際溫度波動范圍為±5℃，1 mL移液管標準不確定度為（mL），10 mL容量瓶標準不確定度為=6.06×10–3（mL），則氨基酸口服液取樣體積的合成標準不確定度

樣品定容體積引入的的不確定度u(V2)為：

4.4 色譜峰面積引入的不確定度

根據儀器說明書和積分儀的一般性能指標分析，目前用于液相色譜儀色譜峰面積積分處理的最大誤差為0.2%～1%，取1%，按均勻分布考慮，則色譜峰面積的標準不確定度為：

其相對標準不確定度為：

4.5 重復性引入的標準不確定度

對氨基酸口服液樣品進行6次重復測量，測量覆蓋本方法的全過程，同時反映稱量、體積等分量的重復性。測得樣品含量分別為8.17，9.06，8.83，9.07， 8.80，8.87 μg/mL，平均值=8.80 μg/mL，標準偏差s =0.329 μg/mL。

因此，重復性引入的相對不確定度為：

4.6 合成標準不確定度

相對標準不確定度由式(4)合成：

把相關數據代入(4)式，求得urel(w)=0.061 9，標準不確定度u (w)=urel(w)×w =0.55 μg/mL。

4.7 計算擴展不確定度

取置信水平P =95%，包含因子k =2，計算擴展不確定度U =k×u (w)=1.1 μg/mL。

5 結果表示

氨基酸口服液中L-色氨酸測量結果可以表達為：w =(8.8 ±1.1)μg/mL。

6 結論

分析結果表明，標準曲線校準及樣品測定的重復性是液相色譜法測定氨基酸口服液中L-色氨酸含量的主要不確定度來源，其中標準曲線校準對總不確定度的影響最大。原因是由于測試樣品的濃度接近檢測限，樣品測試的重復性變差，通過選擇合適的、可行的試驗方案，譬如富集樣品中L-色氨酸等可以有效減小不確定度，保證測量結果的準確、可靠。

［1］ Mackay G M, Forrest C M, Stoy N, et al.Tryptophan metabolism and oxida tive stress in patients with chronic brain injury［J］.Eur J Neurol，2006(13): 30–42.

［2］ Agazzi A, Ponti F D, Giorgio R D, et al.Review of the implications of dietary tryptophan intake in patient with irritable bowel syndrome and psychiatric disorders［J］.Dig Liver Dis，2003，35(8): 590–595.

［3］ CNAS–GL06：2006 化學分析中不確定度的評估指南［S］.

［4］ JJF 1059–1999 測量不確定度評定與表示［S］.

Uncertainty Evaluation of Determinnation of L-Tryptophan in Amino-Acid Oral Liquid by HPLC

Bao Zhijuan， Zhou Jinyan， Yang Yi
(Guangdong Institute of Metrology， Guangdong 510405， China)

L-trypotphan (TRP) in amino-acid oral liquid was detected by HPLC，and the measurement uncertainty was evaluated. The results indicated that the calibration of the standard curve and repeatability mainly affected the measurement uncertainty of L-TRP in amino-acid oral liquid. The calibration of the standard curve was the largest contribution to the whole measurement uncertainty. As the content of L-TRP was 8.8 μg/mL，the expanded uncertainty was 1.1 μg/mL.

L-tryptophan; HPLC; amino-acid oral liquid; measurement uncertainty

O657.7

A

1008–6145(2012)02–0014–03

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.02.004

* 廣東省質監(jiān)局科技計劃項目（2010CB01）

聯(lián)系人：保志娟；E-mail: baozhij@yahoo.com.cn

2011–10–20