曲冠證 鄭唐春 杜兆偉 趙思雯 夏德安

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

檉柳(Tamarix hispida)是分布在干旱荒漠區(qū)域的抗脅迫性較強(qiáng)的生態(tài)植物，除具有抗干旱能力外，還主動(dòng)將積累的鹽分儲(chǔ)存在液泡中而實(shí)現(xiàn)區(qū)隔化［1－2］。因此，檉柳是進(jìn)行林木抗逆研究的理想物種。通過(guò)對(duì)檉柳cDNA文庫(kù)的測(cè)序及Blast比較分析，獲得了一個(gè)具有完整開(kāi)放讀碼框的基因序列(GenBank No.EG971462)，其與擬南芥中命名為C2H2 型鋅指蛋白(AT5G16470，AT3G02790，TAIR)的基因具有較高的相似性(氨基酸序列相似性約為80%)。植物鋅指蛋白是一類(lèi)廣泛研究的抗逆性基因蛋白，例如在胡椒中克隆的新基因CaAbsi1、從菊花中分離的DgZFP基因和鋅指蛋白基因Tsip1轉(zhuǎn)煙草中都對(duì)NaCl、干旱、冷凍及激素等脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)［3－5］。但通過(guò)對(duì) SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 Blast未發(fā)現(xiàn)有相似的已知植物蛋白基因，因此可以認(rèn)為此基因?yàn)橐粋€(gè)新基因，故暫時(shí)命名該基因?yàn)門(mén)hZFL(Tamarix hispida Zinc finger like gene)［6］。

本試驗(yàn)在前期的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行鹽脅迫、干旱脅迫處理，探究ThZFL基因在應(yīng)對(duì)非生物脅迫的生理功能。通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)，篩選與ThZFL基因表達(dá)的蛋白具有相互作用的蛋白，為研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互聯(lián)系提供支持，也為探究新基因的生理功能提供理論依據(jù)。通過(guò)克隆ThZFL基因的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化擬南芥分析表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步探究該基因的生理功能、分析抗逆機(jī)制的形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用煙草野生型為Nicotiana tabacum‘Havana SRI’;擬南芥野生型為 Columbia－0 型;酵母雙雜交表達(dá)載體pGBKT7－BD、對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7－53、pGBKT7－lam、pGADT7－T、Y2Hgold 和 Y187 酵母菌種，酵母省缺培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化試劑均購(gòu)自Clontech公司;PCR相關(guān)試劑、DNA marker、pMD18－T載體、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase均購(gòu)自TaKaRa公司(中國(guó)，大連);EasyPure Plant RNA Kit(Transgen，中國(guó));其他試驗(yàn)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 ThZFL基因轉(zhuǎn)煙草的非生物脅迫分析

鹽脅迫下種子的發(fā)芽率 將收獲的轉(zhuǎn)基因煙草種子消毒后點(diǎn)種到含有200 mmol/L NaCl MS培養(yǎng)基中，放到培養(yǎng)室中從第7天起開(kāi)始統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，以野生型煙草種子為對(duì)照。

鹽脅迫下葉片的分化情況 將轉(zhuǎn)基因煙草組培苗的葉片切成1 cm×1 cm的小塊，轉(zhuǎn)移到含有200 mmol/LNaCl的MS分化(MS+0.5mg/L6－BA+0.05 mg/L NAA)培養(yǎng)基上，觀察葉片的分化情況，以野生型煙草葉片為對(duì)照。

鹽及干旱脅迫下植株的生長(zhǎng)狀況 將3周大小的轉(zhuǎn)基因煙草7、16、20、21號(hào)株系幼苗種植到土壤中，壯苗一周后，用200 mmol/L的NaCl溶液澆灌煙草植株，每隔3 d澆水一次。在處理后的第3天、第7天、第14天測(cè)量植株高度。40 d后將煙草植株用清水洗凈，晾干后測(cè)量鮮質(zhì)量，烘干后測(cè)量干質(zhì)量;同時(shí)，另一組一直不澆水，進(jìn)行干旱處理，觀察20 d后的生長(zhǎng)狀況。

ThZFL基因互作蛋白的篩選 從檉柳cDNA文庫(kù)中克隆出ThZFL目的基因序列，用 BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后連接到pGBKT7－BD載體中，獲得重組質(zhì)粒pGBKT7－ThZFL。轉(zhuǎn)化酵母Y2Hgold菌株，對(duì)轉(zhuǎn)化后的酵母涂布 SD/－Trp、SD/－Trp/X、DDO、TDO平板，驗(yàn)證目的基因無(wú)自激活作用，通過(guò)對(duì)酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定驗(yàn)證誘餌蛋白無(wú)毒性作用［7］。將活化好的含有誘餌表達(dá)載體的Y2Hgold菌，與構(gòu)建好的檉柳酵母文庫(kù)Y187菌進(jìn)行酵母雜交，然后涂布TDO平板。3 d后挑取三缺板上的單克隆轉(zhuǎn)移到QDO/X/A平板，初步檢驗(yàn)陽(yáng)性克隆。從酵母中營(yíng)救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，送北京六合華大公司測(cè)序。

ThZFL基因啟動(dòng)子的克隆及其表達(dá)分析 用CTAB法提取檉柳基因組DNA［8］，根據(jù)已知的ThZFL基因序列設(shè)計(jì)3條特異引物:Th－SP1/Th－SP2/Th－SP3(表1)，設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域。以檉柳基因組DNA為模板，分別以AP1、AP2、AP3、AP4引物為上游引物。根據(jù)染色體步移試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行3輪PCR。將PCR產(chǎn)物膠回收后連接pMD18－T載體，送北京六合華大公司測(cè)序。根據(jù)啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子特殊引物Th－PF/Th－P－R(表1)，用限制性內(nèi)切酶 NcoI和 Hind III將啟動(dòng)子剪切后連入NcoI和Hind III內(nèi)切酶處理的pCAMBIA－1301載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體p1301－PThZFL－gus。然后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌中，采用浸花法侵染野生型擬南芥，獲得轉(zhuǎn)p1301－PThZFL－gus擬南芥植株［9］。

表1 ThZFL基因啟動(dòng)子克隆引物匯總

播種轉(zhuǎn)基因種子后，在幼苗期取材，放入GUS染色液中在37℃染色10 h，然后用卡諾固定液(V(無(wú)水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)脫色并拍照［10］。GUS染色液配制如下:100 mmol/L sodium phosphate、pH=7.0，1 mmol/L 5－bromo－4－chloro－3－indolyl－β－D－glucuronide，0.5 mmol/L potassium ferrocyanide，0.5 mmol/L potassium ferricyanide，10 mmol/L Na2EDTA and 0.1%Triton X－100。用透明劑(V(水)∶V(甘油)∶V(乳酸)∶V(苯酚)=1∶1∶1∶2)處理擬南芥幼苗后，放在Zeiss熒光實(shí)體顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 ThZFL基因轉(zhuǎn)煙草的非生物脅迫分析

2.1.1 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率

將種子種在含有200 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率，結(jié)果如表2和圖1A。非脅迫條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草種子的發(fā)芽率幾乎都為100%，差異不大。200 mmol/L NaCl脅迫后，發(fā)芽率差異較大。轉(zhuǎn)基因煙草種子各株系發(fā)芽率降低，為60%左右，而野生型煙草種子的發(fā)芽率降到10%左右。以上結(jié)果表明，ThZFL基因的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草種子的抗鹽能力。

表2 ThZFL轉(zhuǎn)煙草種子發(fā)芽率

2.1.2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草離體葉片生長(zhǎng)情況

將轉(zhuǎn)基因煙草葉片在含有200 mmol/L NaCl的分生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，1個(gè)半月后觀察的結(jié)果如圖1B。野生型煙草在脅迫初期是緩慢進(jìn)行分化的，但隨著時(shí)間的變化，野生型煙草葉片逐漸褐化，喪失分化能力，最后死亡;而轉(zhuǎn)基因煙草葉片則能在含鹽的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)分化生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，ThZFL基因的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草葉片的抗鹽能力。

2.1.3 鹽及干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株的生長(zhǎng)情況

轉(zhuǎn)基因煙草植株在鹽和干旱脅迫下的結(jié)果如圖2。在200 mmol/L NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因煙草長(zhǎng)勢(shì)高于野生型一倍左右(表3)，在處理40 d后，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片和莖比野生型煙草鮮艷，葉綠素含量更高;通過(guò)對(duì)根的比較發(fā)現(xiàn)，受脅迫后，野生型煙草的根系發(fā)育遲緩，根系不如轉(zhuǎn)基因植株發(fā)達(dá)，側(cè)根條數(shù)較少，根部出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象(圖2A);通過(guò)脅迫后植株的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的相對(duì)含水量差異不大，但轉(zhuǎn)基因株系根干質(zhì)量比野生型的高2～3倍，與圖2A中根系發(fā)達(dá)程度相近(表4)。干旱脅迫20 d后，轉(zhuǎn)基因株系比野生型植株抗旱能力稍強(qiáng)一些，轉(zhuǎn)基因煙草植株比野生型茁壯，葉片保綠保水程度更高一些，復(fù)水24 h后植株恢復(fù)能力更強(qiáng)(圖2B)。以上結(jié)果說(shuō)明，ThZFL基因的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗鹽、抗旱能力。

圖1 ThZFL轉(zhuǎn)煙草的鹽脅迫試驗(yàn)

表3 ThZFL轉(zhuǎn)煙草200 mmol/L NaCl處理植株長(zhǎng)勢(shì)

表4 ThZFL轉(zhuǎn)煙草200 mmol/L NaCl處理的植株質(zhì)量

圖2 ThZFL轉(zhuǎn)煙草植株的脅迫試驗(yàn)

2.2 與ThZFL蛋白互作蛋白的篩選

誘餌 Y2Hgold(pGBKT7－ThZFL)和檉柳文庫(kù)Y187(pGADT7－library)酵母雜交后，涂布TDO平板，長(zhǎng)出單克隆后進(jìn)行菌落PCR。PCR結(jié)果顯示，目的基因的長(zhǎng)度為500～1 000 bp(圖3A)。然后轉(zhuǎn)移到QDO/X/A平板上，初步篩選到10多個(gè)陽(yáng)性克隆(圖3B)。通過(guò)測(cè)序結(jié)果分析，陽(yáng)性克隆多為重復(fù)序列。最后檢測(cè)得到一個(gè)與誘餌(pGBKT7－ThZFL)互作的蛋白。通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)以及進(jìn)一步的雙雜交驗(yàn)證，確認(rèn)這個(gè)基因是與ThZFL互作的蛋白。此基因開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為462 bp，可預(yù)測(cè)編碼153個(gè)氨基酸序列(圖3C)。

2.3 ThZFL基因啟動(dòng)子的克隆

利用染色體步移法經(jīng)過(guò)3輪PCR后，電泳檢測(cè)到一條長(zhǎng)度1 200 bp左右的片段，將該片段回收連接到pMD18－T克隆載體中，測(cè)序后通過(guò)序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該序列與ThZFL基因的ORF的30個(gè)堿基序列一致，說(shuō)明擴(kuò)增得到的序列包含ThZFL基因的上游啟動(dòng)子序列。用Bioedit軟件將序列拼接后，獲得1 185 bp的ThZFL的啟動(dòng)子序列(圖4)。利用PLACE 數(shù) 據(jù) 庫(kù) (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)，對(duì)獲得的 ThZFL啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。ThZFL啟動(dòng)子含有7個(gè)元件:(1)TATA－box，RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合的位點(diǎn)，是核心的啟動(dòng)子元件。(2)CAAT－box，可能與轉(zhuǎn)錄的起始頻率有關(guān)，有增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的作用，是真核生物基因啟動(dòng)子典型元件之一。(3)ARE元件:序列中含有1個(gè)ARE元件，與厭氧誘導(dǎo)有關(guān)。(4)CGTCA－motif和TGACG－motif:序列中含有5個(gè)，這兩種元件與茉莉酸(MeJA)誘導(dǎo)相關(guān)。(5)HSE元件:序列中含有1個(gè)HSE(heat stress element)元件，與熱反應(yīng)相關(guān)。(6)GATA－motif、GT1－motif、LAMP－element和 Sp1:都是與光作用的順式元件。(7)TC－rich repeats:和防御與脅迫相作用的元件。

圖3 酵母雙雜交篩選互作蛋白

圖4 ThZFL基因啟動(dòng)子的堿基序列

2.4 ThZFL基因啟動(dòng)子在擬南芥中的表達(dá)模式

將檉柳ThZFL基因啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體p1301－PThZFL－gus，用 ThZFL 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) GUS 基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株GUS活性檢測(cè)表明:擬南芥幼苗幾乎整株表達(dá)(圖5A)，幼嫩的葉片和莖尖分生組織表達(dá)較弱(圖5B)，葉脈表達(dá)強(qiáng)一些(圖5C)，而老葉中GUS活性明顯減弱，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)毛狀體中GUS表達(dá)較強(qiáng)(圖5D)。

圖5 ThZFL－Promotor轉(zhuǎn)擬南芥植株的GUS活性檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

檉柳生長(zhǎng)于環(huán)境惡劣的荒漠地區(qū)，在自然選擇的條件下，適應(yīng)嚴(yán)酷條件的抗性基因得到富集與積累。例如，王玉成等［11］從檉柳中克隆到一個(gè)新的bZIP基因，在轉(zhuǎn)基因煙草中能增強(qiáng)過(guò)氧化酶(POD)和過(guò)氧化物歧化酶(SOD)的活動(dòng)，并增加可溶性糖與可溶性蛋白質(zhì)的含量;Guo XiaoHong等［12］從檉柳根系鹽脅迫cDNA文庫(kù)中分離出一個(gè)編碼冷凍適應(yīng)蛋白基因ThCAP，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)對(duì)低溫具有較強(qiáng)的抵抗能力;最新研究表明，檉柳ThVHAc1轉(zhuǎn)酵母菌株能提高對(duì)鹽、干旱、紫外線、氧化劑、重金屬、冷凍和高溫的耐性［13］。所以從檉柳基因組中探究新基因的生理功能具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與生態(tài)意義。

酵母雙雜交是一種簡(jiǎn)便快速研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種方法，與傳統(tǒng)的方法相比，其最大的優(yōu)勢(shì)在于不用分離純化蛋白質(zhì)，而是將所研究的基因置于真核酵母細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)目的蛋白，從而為蛋白的功能修飾提供一個(gè)場(chǎng)所。研究中從檉柳cDNA文庫(kù)中篩選出一個(gè)與ThZFL基因互作的基因序列，該基因也未見(jiàn)報(bào)道，其基因的功能將在以后進(jìn)一步深入研究。

目前鋅指蛋白基因主要應(yīng)用于植物抗旱、耐鹽、抗凍以及抗病研究上。Kim等［14］從大豆中克隆了一個(gè)鋅指基因ZPT223，然后轉(zhuǎn)染擬南芥和煙草后，能顯著提高轉(zhuǎn)基因植物抗干旱脅迫能力;Mukhopadhyay等［15］也從水稻中克隆了一個(gè)鋅指基因OSISAP1，轉(zhuǎn)基因煙草同樣表現(xiàn)出對(duì)干旱、鹽漬的抗性增強(qiáng)。Sakamoto等［16］克隆了擬南芥鋅指基因AZF1、AZF2、AZF3，發(fā)現(xiàn)這些基因在干旱、高鹽、冷和外源ABA的誘導(dǎo)下表達(dá)量增高。ThZFL基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，GUS活性顯示:該啟動(dòng)子的表達(dá)部位在幼苗的整體、葉脈和毛狀體中表達(dá)顯著，但在莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)處表達(dá)微弱，推測(cè)ThZFL基因主要在成熟組織中發(fā)揮抗逆作用。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)檉柳ThZFL基因煙草對(duì)鹽漬、干旱等非生物脅迫具有顯著的增強(qiáng)效果，說(shuō)明該基因可能參與植物逆境脅迫調(diào)節(jié)。盡管ThZFL基因的同源基因在擬南芥中被標(biāo)注為鋅指基因，但實(shí)際上檉柳ThZFL基因完全不屬于鋅指蛋白基因家族，而是一個(gè)新基因［3］。

因?yàn)樽匀画h(huán)境的原因，我國(guó)干旱、鹽堿地面積廣大，嚴(yán)重制約著農(nóng)業(yè)、林業(yè)的發(fā)展。研究表明，植物抗鹽機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的，是受植物多基因控制的［17］，因此檉柳ThZFL基因在生物工程中作為一個(gè)優(yōu)良的抗性基因，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)中或許可以起到重要的作用。

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