陳名智 林名瑞 肖雄箭 林建東

膿毒癥是ICU的常見病，病死率高，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在ICU感染病人中，30.8%有嚴(yán)重的膿毒癥或膿毒癥休克，病死率可達(dá)38.96%[1]。因此早期有效的診斷加及時(shí)的干預(yù)顯得十分必要。膿毒癥是由微生物感染引起的炎癥性反應(yīng)綜合征，其引起代謝物的變化特別是血液中不飽和脂肪酸的濃度改變對(duì)病程發(fā)展起著重要的作用[2-3]。

烏司他丁（Ulinastatin,UTI）對(duì)膿毒癥大鼠的臟器的保護(hù)的研究并不少見，無論是從常規(guī)臨床生化指標(biāo)，還是從基因水平上都有相應(yīng)的研究，而在此方面代謝組學(xué)的研究尚未有相關(guān)的報(bào)道代謝組學(xué)作為繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的一門新興學(xué)科，目前已廣泛應(yīng)用于各種臨床疾病的研究，在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC／MS對(duì)烏司他丁預(yù)處理的膿毒癥大鼠代謝物主要是不飽和脂肪酸進(jìn)行定性和定量分析，試圖在代謝水平上對(duì)烏司他丁保護(hù)膿毒癥患者臟器發(fā)生機(jī)制做一些初步探討，同時(shí)HPLC/MS對(duì)膿毒癥的早期診斷也有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備與分組健康雄性Wistar大鼠30只[動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005]，體重（200±20）g（購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。隨機(jī)等分成3組。烏司他丁組（UTI組）制模前1h肌注UTI（天普洛安，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）10萬(wàn)U/kg，對(duì)照組和膿毒癥組則分別肌注平衡液5mL/kg；UTI組和膿毒癥組均按Otero等[4]介紹的CLP方法建立大鼠腸源性膿毒癥模型。正常對(duì)照組則行開腹、關(guān)腹，但不予盲腸結(jié)扎穿孔。3組術(shù)畢均皮下注射平衡液50mL/kg以補(bǔ)充術(shù)中丟失的體液并抗休克治療，術(shù)后正常飲食、自由飲水。

表1 已推定代謝物的MS裂解碎片及其在各組大鼠血清中的相對(duì)濃度（±s）

表1 已推定代謝物的MS裂解碎片及其在各組大鼠血清中的相對(duì)濃度（±s）

注：與對(duì)照組相比aP＜0.05，與烏司他丁組相比bP＜0.05

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1.2 血液標(biāo)本的采集于術(shù)后12h經(jīng)尾靜脈采血0.5mL，靜置、離心后收集上清液，-80℃凍存，待行HPLC／MS分析。HPLC／MS分析前，取出冷凍標(biāo)本，自然解凍后取血清200μL加至含乙腈400μL的1mL離心管中，充分振蕩30s、靜置10min后1000G離心5min，取上清液，經(jīng)0.2μL注射器式濾器過濾后行HPLC／MS分析。

1.3 觀察指標(biāo) Agilent-1100型分析儀(Agilent，MA，USA)進(jìn)行HPLC／MS分析。高效液相色譜梯度洗脫程序、相關(guān)步驟、數(shù)據(jù)處理及標(biāo)志物鑒定方法參照文獻(xiàn)[3]的研究設(shè)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過比較各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物的關(guān)系來說明烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠臟器的良好保護(hù)作用及HPLC/MS對(duì)膿毒癥的早期診斷的重要意義。

2 結(jié)果

2.1 主成分分析（PCA）采用PCA方法對(duì)對(duì)照組、膿毒癥組和烏司他丁預(yù)處理組的正、負(fù)離子模式下對(duì)血清樣本的代謝譜數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別。根據(jù)各組大鼠血清的總離子色譜圖(total ion chromatograms，TIC)，比較分析質(zhì)荷比和保留時(shí)間，從每一樣品中總共確認(rèn)了787個(gè)譜峰。并通過ANOVA檢驗(yàn)從其中找出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的155個(gè)譜峰。對(duì)HPLC／MS數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA后，可獲得由第一、第二主成分構(gòu)成包含了60%的總方差的PCA得分圖(圖1A)。該得分圖提示，所有樣品完全按照組別進(jìn)行聚類，這表明基于HPLC／MS的代謝組學(xué)技術(shù)能很好地反映假手術(shù)組、膿毒癥組和烏司他丁預(yù)處理組大鼠血清樣品的代謝特征，并將其完全區(qū)分開來。

2.2 重要代謝物的鑒定和分析 從載荷圖（圖1B）圓外區(qū)域，12個(gè)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物可以認(rèn)定。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查找、QT-TOF LC／MS裂解碎片驗(yàn)證，8個(gè)代謝物被結(jié)構(gòu)性推斷，它們是亞麻酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、軟脂酸、亞油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯醇；如表1所示，假手術(shù)組大鼠血清亞油酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、軟脂酸和硬脂酸水平最高，其次是UTI組，再次是膿毒癥組。這表明，UTI預(yù)處理組與膿毒癥組相比，血清中上述游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)濃度明顯升高，且差異具有顯著意義（見表1）。這表明UTI預(yù)處理后，具有抗炎癥、抗氧化作用的多不飽和脂肪酸血清水平明顯增加，這可能改善膿毒癥大鼠預(yù)后。

圖1 A圖：橄圓內(nèi)為膿毒癥組，正方形內(nèi)為生存組，余為對(duì)照組。B圖：圓形為Hotelling’s T2統(tǒng)計(jì)量閾值為變量，圓外的變量為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物(P<0.05)。

2.3 療效的判斷 標(biāo)志物信息構(gòu)建的模型有其臨床的參考價(jià)值，但利用所有代謝物信息構(gòu)建的模型預(yù)測(cè)效能總體上會(huì)高一些，在方法上采用RBFNN構(gòu)建的模型預(yù)測(cè)效能高于k-NN[3]。

3 討論

膿毒癥作為內(nèi)、外科危重病人常見的病，?？砂l(fā)展為膿毒癥性休克、多器官功能障礙綜合征。在此種情況下往往存在機(jī)體高代謝和高消耗為主要特征的代謝紊亂，常表現(xiàn)為蛋白強(qiáng)噬性和自噬性的負(fù)氮平衡及組織對(duì)葡萄糖攝取和脂肪代謝障礙等代謝紊亂[5]，對(duì)病情的發(fā)展起著重要的推進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)方法來分析膿毒癥時(shí)機(jī)體早期的代謝變化及烏司他丁是否對(duì)其表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，以實(shí)現(xiàn)膿毒癥的早期診斷以便及時(shí)干預(yù)，以延緩病情改善愈后。

3.1 烏司他丁對(duì)膿毒癥的治療作用 研究表明烏司他丁能抑制胰蛋白酶、α糜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等多種水解酶的活性。結(jié)構(gòu)上，UTI具有兩個(gè)活性功能區(qū)，這種不完全重疊且有多種酶的獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)決定了它的廣譜抑酶活性，可同時(shí)抑制胰蛋白酶、α糜蛋白酶、磷脂酶A2、酸性蛋白酶、粒細(xì)胞彈性蛋白酶、羧基肽酶、巰基酶等多種水解酶的活性，且抑制效率高從而減輕水解酶對(duì)正常組織器官的傷害，一定程度上清除致炎因子，緩解炎癥反應(yīng)。同時(shí)有研究表明UTI對(duì)單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞過度釋放的炎癥介質(zhì)也有抑制作用[6]。此外研究還發(fā)現(xiàn)它能夠抑制肺泡溶酶體酶及各種炎癥因子產(chǎn)生,穩(wěn)定溶酶體膜而保護(hù)肺臟，維持呼吸功能[7-9]。

3.2 建模時(shí)機(jī) 研究發(fā)現(xiàn)CLP術(shù)后12h，膿毒癥大鼠血清代謝特征已發(fā)生明顯改變,故本實(shí)驗(yàn)把血液標(biāo)本采集時(shí)間點(diǎn)設(shè)在膿毒癥大鼠建模后的12h[3]。

3.3 膿毒癥患者脂類代謝的特異性 膿毒癥患者機(jī)體處于高度的應(yīng)激狀態(tài)，代謝發(fā)生劇烈的變化：血糖升高、脂肪動(dòng)員增強(qiáng)、蛋白質(zhì)分解增強(qiáng)[10]。但膿毒癥后，機(jī)體中游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)卻呈明顯下降趨勢(shì)[11]。游離脂肪酸主要參與氧化供能，比如亞油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、軟脂酸和硬脂酸，且其降低程度與膿毒癥預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[3]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，經(jīng)烏司他丁預(yù)組大鼠的游離脂肪酸明顯高于膿毒癥組，且趨向于接近對(duì)照組（P<0.05）。說明烏司他丁能有效的保護(hù)膿毒癥患者，提高患者的血中不飽和脂肪酸的濃度，從而保證了患者機(jī)體的氧供。其機(jī)理可能為烏司他丁抑制了內(nèi)毒素和炎癥因子釋放，降低了脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性同時(shí)抑制FAT／CD36基因的表達(dá)，進(jìn)而減少FFA被快速轉(zhuǎn)運(yùn)至肌肉或組織的機(jī)會(huì)[11]，故烏司他丁組大鼠血中FFA總體水平下降不明顯從而對(duì)膿毒癥患者的能量代謝起改善作用。

近年來研究表明膿毒癥時(shí)免疫系統(tǒng)的紊亂是促使病情發(fā)展的重要原因。在機(jī)體遭到強(qiáng)烈刺激時(shí)，補(bǔ)體C5a經(jīng)旁路途徑大量產(chǎn)生，使中性粒細(xì)胞功能下降，增加了感染的易感性。大量炎癥介質(zhì)釋放，如TNF-α、IL-1、GM-CSF等[12]，從而中性白細(xì)胞凋亡率下降，血中的中性白細(xì)胞數(shù)顯著增加；由于粒細(xì)胞脫粒時(shí)釋放髓過氧化物酶、彈性蛋白酶、蛋白酶氧自由基、纖溶酶原激活物等。這些代謝都可增加了自身機(jī)體組織的損壞。因此，在過度免疫的情況下一方面機(jī)體對(duì)致病菌的易感性增高，使炎癥反應(yīng)持續(xù)并加劇[13]。機(jī)體在感染和創(chuàng)傷刺激下，不僅釋放促炎介質(zhì)，同時(shí)也反饋性釋放內(nèi)源性抗炎介質(zhì)（IL-4、IL-10、TGFβ），引起機(jī)體免疫抑制。然而研究表明ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3 PUFAs）具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[14-15]。ω-3 PUFAs抗炎及免疫作用的主要機(jī)制是ω-3 PUFAs通過與花生四烯酸競(jìng)爭(zhēng)代謝通路來抑制炎癥細(xì)胞因子白介素-1β( I L-1β)和腫瘤壞死因子-α( T NF-α)的分泌，還能抑制 PGE2和LTB4的生成，減少白細(xì)胞的游走和滲出使炎癥的消退組織修復(fù)加快[16-17]。同時(shí)ω-3 PUFAs作為細(xì)胞膜的組成成份可抑制脂筏信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而對(duì)免疫細(xì)胞起抑制作用。此外ω-3 PUFAs及其代謝產(chǎn)物也能影響免疫細(xì)胞活性的作用即抑制抗原呈遞作用而抑制淋巴細(xì)胞激活及免疫分子表達(dá)等[18]。ω-3 PUFAs一族中藥理功能明顯的是亞麻酸和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。而本實(shí)驗(yàn)中的UTI預(yù)處理組大鼠血液中的亞麻酸、DHA明顯高于膿毒癥組，從一定程度上可以說明UTI對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)有作用，可作為臨床膿毒癥患者的輔助治療藥物。

綜上所述，膿毒癥導(dǎo)致機(jī)體的代謝紊亂特別是與能量代謝相關(guān)的不飽和脂肪酸代謝的紊亂對(duì)其病程的發(fā)展起著重要的作用。經(jīng)過UTI預(yù)處理膿毒癥大鼠脂代謝的紊亂得到不同程度的糾正，表明UTI在一定程度上對(duì)膿毒癥患者機(jī)體的脂代謝紊亂有改善作用，可緩解病情，爭(zhēng)取治療時(shí)間。

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