桑 宇 張段玲 錢毓斌 張彥龍

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

水貂阿留申病(Aleutian Ddisease，AD)是由阿留申病毒(Aleutian disease parvovirus，ADV)引起的水貂慢性傳染性疾病，主要侵害水貂的免疫系統(tǒng)，以漿細胞彌漫性增生和持續(xù)性病毒血癥為特征［1－2］。AD在有水貂飼養(yǎng)的國家普遍存在，臨床上主要表現(xiàn)為水貂產(chǎn)仔量降低、死胎、流產(chǎn)、腎小球腎炎、動脈血管炎和肝炎，并導致成年水貂的免疫系統(tǒng)紊亂，仔貂突發(fā)嚴重肺炎而死亡［3］。病理剖檢常見腎腫大、充血而呈紅色，后變灰褐色或淡黃褐色，有的表面可見斑點狀出血，間有灰白色壞死灶［4］。水貂AD發(fā)病率約75%，直接死亡率可達30%［5］。病貂毛皮質(zhì)量下降，對水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［6－7］。

對流免疫電泳(CIEP)是現(xiàn)今世界公認的并且應用最為廣泛的AD檢測方法，通過CIEP檢測淘汰AD陽性貂對貂群進行凈化，是目前AD防控唯一有效的方法。雖然我國已經(jīng)研制出AD的CIEP診斷抗原，但由于我國水貂養(yǎng)殖方式和對AD危害認識不足等原因，AD檢測凈化一直沒有得到廣泛的推廣。近年，國際毛皮市場的旺盛需求帶動了我國水貂養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴大，但由于管理上的不完善等原因?qū)е挛覈魽DV感染率居高不下，初步統(tǒng)計ADV的感染率高達80%～90%。AD對我國水貂養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的影響越來越嚴重，加強檢測凈化工作已經(jīng)逐漸被廣大養(yǎng)殖場(戶)所認識和接受。為了深入了解近年來我國ADV的流行情況，并利用當前的流行毒株研制新的診斷抗原，筆者從送檢水貂樣本中分離出一株ADV(命名為ADV－ZYL1)，對其VP2序列進行測定，基于氨基酸的同源性繪制分析表，闡明ADV－ZYL1毒株的抗原變異情況，為進一步開展該病的診斷和防治研究奠定基礎。

1 試驗材料

病料 山東威海養(yǎng)殖戶送檢的疑似ADV感染致死的水貂樣本，采集其實質(zhì)器官，置于－20℃保存。

試劑和細胞 蛋白酶K、PMD18－T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;胰蛋白酶、DMEM購自Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、感受態(tài)大腸桿菌DH5α、小量膠回收試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;小牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司;貓腎傳代細胞系(CRFK)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫;ADV陽性核酸為東北林業(yè)大學野生動物資源學院動物醫(yī)學實驗室保存。

引物 檢測用的特異性引物參考Qie等［8］的研究報告。上游P1:5'－CTTGTCACGCTACTAGAATGGT－3'(2 587 ～2 609 bp);下游 P2:5'－AGCTTAAGGTTAGTTTACATGGTTTACT－3'(3 252 ～3 279 bp)?？蓴U增的目的DNA片段的長度為693 bp。參考GenBank中保存的標準毒株ADV－G(M20036)核苷酸序列，利用引物設計軟件Oligo 6.0分別設計合成兩對引物，用于擴增 VP2全序列。上游AD1:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(2 336～2 355 bp);下游 DV1:5'－TTGGTTGGTATGAGTTAAGTAG－3'(3 921～3 942 bp)。擴增的目的片段命名為part.1，長度為1 606 bp。上游 AD2:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(3 810～3 831 bp);下游 DV2:5'－TATTCAGCAAGCAAAAAAGAAG－3'(4 452 ～4 474 bp)。擴增的目的片段命名為part.2，長度為664 bp。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2 試驗方法

2.1 DNA的提取及PCR檢測

取水貂部分臟器，用剪刀盡量剪碎，加入600 μL 的1×TNE(消化緩沖液)，40 μL 蛋白酶 K，80 μL 10%SDS，55℃消化過夜。向各試管加入720 μL的平衡酚(V(酚)∶V(氯仿)=1∶1的混合溶液)，震蕩搖勻成乳濁液，放置0.5 h，4℃條件下12 000 r/min離心15 min。取700 μL上清液加入等體積的異丙醇，搖勻靜置30 min，4℃條件下12 000 r/min離心15min，棄上清。沉淀用75%預冷乙醇洗滌，12 000 r/min離心5 min，棄上清，干燥后加入10～20 μL滅菌純水。溶解后以紫外分光光度計定量為1 g/L。檢測引物P1、P2的PCR反應條件:94℃預變性 3 min，94 ℃ 0.5 min，50 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，進行40個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。反應結(jié)束后取5 μL擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖進行電泳，觀察結(jié)果。

2.2 病毒分離

將臟器置于研缽中并在冰上研碎，按研碎組織體積占據(jù)30%的比例加入DMEM制備組織懸液，懸液以12 000 r/min離心15 min，收集上清，以0.22 μm濾膜除菌后用于病毒的細胞培養(yǎng)。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)CRFK細胞，細胞長成單層后傾去培養(yǎng)液，加入除菌組織懸液2 mL于31.8℃吸附2 h［9］，中間晃動數(shù)次，傾倒出吸附液，然后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于二氧化碳恒溫箱中31.8℃培養(yǎng)，以3～4 d作為標準，盲傳至出現(xiàn)病變后收獲各代病毒培養(yǎng)物。

2.3 分離病毒的PCR檢測和VP2全基因序列克隆測定

對出現(xiàn)病變后收獲的各代病毒培養(yǎng)物提取DNA，12 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入490 μL的1×TNE(消化緩沖液)，10 μL 蛋白酶K，55 ℃消化過夜，其余步驟同2.1。以引物P1、P2進行PCR擴增，反應結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。用兩對測序引物AD2、DV2和AD1、DV1分別對病毒分離前后的DNA進行PCR擴增。PCR采用25 μL體系。取2 μg DNA 作為模板，加入 10×Buffer 2.5 μL，上下游引物各1 μL、2.5 mmol/L 的 dNTP 2 μL、最后加0.5 μL 的 Taq 酶，用滅菌純水補足到25 μL。反應結(jié)束后分別進行電泳切膠回收，純化產(chǎn)物連接PMD18－T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α，PCR檢測陽性單克隆菌落送英駿公司進行測序。測定結(jié)果編輯后用MEGA4.1和GenBank中國內(nèi)外已發(fā)表的水貂阿留申病毒VP2蛋白氨基酸序列進行同源性比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 病料的PCR初步檢測

提取幼貂臟器的DNA，并利用引物P1、P2進行PCR擴增。在脾臟DNA中得到了與預期擴增片段(693 bp)相符的核酸電泳帶，見圖1。

圖1 PCR檢測結(jié)果

3.2 病毒分離

將PCR檢測為陽性的脾臟碾磨過濾除菌，除菌后的組織懸浮液吸附于單層的CRFK細胞，31.8℃培養(yǎng)3代無明顯細胞病變，盲傳到第4代培養(yǎng)96 h后，細胞系出現(xiàn)嚴重的細胞脫落，并有大量空斑，形成CPE(cytopathic effect)。繼續(xù)在31.8℃條件下培養(yǎng)到第10代，仍見大量空斑和明顯的CPE(圖2)，凍融收集培養(yǎng)液。

圖2 分離毒株感染CRFK細胞后第10代96 h的形態(tài)觀察

3.3 分離病毒的PCR檢測及VP2序列測定

細胞培養(yǎng)物提取DNA后PCR檢測仍為陽性(圖3)，對病毒分離前后提取的DNA分別用AD1、DV1和AD2、DV2兩對引物進行擴增，得到了預期大小的擴增片段，見圖4。切膠純化后克隆測序表明，分離前后病毒序列無變化，登陸基因數(shù)據(jù)庫比對其測序結(jié)果，該結(jié)果與美國標準毒株ADV－G的VP2核苷酸同源性為94.7%，進一步證明了ADVZYL1為水貂阿留申病毒，而且此毒株可以在CRFK細胞中穩(wěn)定生長。

圖3 病毒分離后培養(yǎng)液PCR檢測結(jié)果

3.4 ADV的VP2蛋白同源性比較

測序結(jié)果用DNAStar進行編輯。將編輯后ADVZYL1毒株的VP2基因與GenBank中的國際毒株ADV－Far East(DQ371395)、ADV－FIN(GQ336866)、ADV－G(M20036)、ADV－LN1(GU183264)、ADV－LN2(GU183265)、ADV －LN3(GU269892)、ADV －SL3(X97629)、ADV－TR(U39013)、ADV－TR2(U39014)、ADV－Utah－1(Z18276)的核苷酸序列進行同源性比較，見表1。結(jié)果顯示，ADV－ZYL1與其它亞型的毒株相比較，VP2蛋白氨基酸同源性為92.6% ～96.1%，其中與強毒力毒株ADV－Utah－1的親緣關(guān)系最近，與遠東毒株ADV－Far East的親緣關(guān)系最遠。

圖4 病毒分離前后培養(yǎng)液PCR檢測結(jié)果

4 結(jié)論與討論

本次試驗病料來源于斷乳前發(fā)病死亡的幼貂，通過病理學剖檢發(fā)現(xiàn)，其具有明顯臟器病變，表現(xiàn)為肺臟出血性炎癥，腎臟腫大、表面有出血點。細菌培養(yǎng)、犬瘟熱病毒和水貂病毒性腸炎等檢測結(jié)果均為陰性。應用已發(fā)表的特異性ADV引物進行PCR檢測呈陽性，因此認為幼貂由ADV感染致死。病料處理后在CRFK細胞連續(xù)培養(yǎng)10代后，獲得了穩(wěn)定毒株ADV－ZYL1。利用設計的擴增VP2基因全序列的引物，分別對病料DNA提取物和病毒細胞培養(yǎng)物DNA進行VP2基因的測序，序列分析結(jié)果顯示，分離前后VP2同源性為100%，進一步驗證了病毒分離結(jié)果的可信度。

表1 11株ADV的VP2基因的氨基酸序列同源性分析結(jié)果

ADV的VP2蛋白由VP2基因編碼而成，在病毒衣殼中占有絕大部分的比重，是其主要抗原決定簇載體［11－12］，可以引起中和抗體反應［13］。人工表達的全VP2蛋白能獨立組裝成病毒衣殼，因此VP2基因的結(jié)構(gòu)決定了病毒的抗原性［14］。近幾年的研究還表明，真核、原核表達的VP2全序列或者VP2片段都可直接用于ELISA和CIEP檢驗，表現(xiàn)出很好的抗原性［15］。對VP2核苷酸和氨基酸的研究有助于研究ADV抗原性，因此本次試驗選擇了對ADV－ZYL1毒株的VP2全序列氨基酸進行分析，結(jié)果表明:ADV病毒雖屬于細小病毒科，但是VP2蛋白的氨基酸突變率介于0.8%到8.8%之間，核苷酸突變率介于0.3%到7.7%之間，遠遠高于同屬于細小病毒科的水貂腸炎病毒和犬細小病毒［16－17］，而且突變氨基酸位點不僅集中在超變區(qū)，還廣泛存在于保守區(qū)，這與之前的報道相一致［18］。ADV－ZYL1毒株與同源性最近的毒株ADV－Utah－1有著24個氨基酸的差別，再次說明了阿留申病毒的氨基酸突變十分明顯。

盡管AD對水貂養(yǎng)殖業(yè)的危害巨大，但是目前國內(nèi)外還未研制出有效預防本病的疫苗，只能通過CIEP檢驗血清淘汰病貂來實現(xiàn)對本病的控制和根除［10］。筆者的研究分析表明，ADV的核苷酸和氨基酸的突變率都很高，國內(nèi)飼養(yǎng)水貂過程中ADV的基因在不斷突變，使用進口抗原進行AD檢測有可能會影響檢測的特異性和敏感性，使得出現(xiàn)假陰性的可能性增加，從而弱化了AD的凈化效果。

［1］殷震，劉景華.動物病毒學［M］.2版.北京:科學出版社，1997.

［2］Fox J M，Stevenson M A，Bloom M E.Replication of Aleutian mink disease parvovirus in vivo is infiuenced by residues in the VP2 protein［J］.Journal of Virology，1999，73(10):8713－8719.

［3］Bloom M E，Alexandersen S，Perryman S，et al.Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus(ADV):sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV［J］.Journal of Virology，1988，62(8):2903－2915.

［4］徐鳳宇，王樹志.水貂阿留申病概述［J］.經(jīng)濟動物學報，2006，10(2):106－111.

［5］朱善元，王健.水貂阿留申病基因檢測芯片的研究與初步應用［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2006，28(6):688－691.

［6］Knuuttila A，Uzcátegui N，Kankkonen J，et al.Molecular epidemiology of Aleutian mink disease virus in Finland［J］.Vet Microbiol，2009，133(3):229－238.

［7］Themudo G E，Ostergaard J，Ersb?ll A K.Persistent spatial clusters of plasmacytosis among Danish mink farms［J］.Preventive Veterinary Medicine，2011，102(1):75－82.

［8］Qie K L，Durrant G，Wolfinbarger J B，et al.The relationship between capsid protein(VP2)sequence and pathogenicity of Aleutian mink disease parvovirus(ADV):a possible role for raccoons in thetransmission of ADV infections［J］.Journal of Virology，1996，70(2):852－861.

［9］Bloom M E，Race R E，Wolfinbarger J B.Characterization of A-leutian disease virus as a parvovirus［J］.Journal of Virology，1980，35(3):836－843.

［10］劉曉，刁燕，杜銳.水貂阿留申病毒的分子生物學研究進展［J］.經(jīng)濟動物學報，2010，14(1):52－55.

［11］梁冬瑩，華育平，曾祥偉.水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位區(qū)的原核表達［J］.東北林業(yè)大學學報，2007，35(6):39－41.

［12］徐磊，閆喜軍，張蕾，等.水貂阿留申病毒VP2基因的原核表達及初步應用［J］.中國農(nóng)學通報，2010，26(8):7－11.

［13］Bloom M E，Best S M，Hayes S F，et al.Identification of Aleutian mink disease parvovirus capsid sequences mediating antibody-dependent enhancement of infection，virus neutralization，and immune complex formation［J］.Journal of Virology，2001，75(2):11116－11127.

［14］Christensen J，Strorgard T，Bloch B，et al.Expression of Aleutian mink disease parvovirus proteins in a baculovirus vector system［J］.Journal of Virology，1993，67(1):229－238.

［15］楊莘，易立，王建科，等.水貂阿留申病毒結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白在疾病診斷與疫苗研發(fā)中的應用［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32(1):69－72.

［16］Zhang Renzhou，Yang Songtao，Zhang Wei，et al.Phylogenetic analysis of the VP2 gene of canine Parvoviruses circulating in China［J］.Virus Genes，2010，40(3):397－402.

［17］Zuo Jing，Rao Jiahui，Xu Huihui，et al.Analysis of the VP2 gene sequence of a new mutated mink enteritis parvovirus strain in PR China［J］.Virology Journal，2010，7:124.

［18］華育平，馬建.阿留申病細小病毒的分離及VP2基因遺傳衍生分析［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2005，36(9):960－963.