池玉杰 伊洪偉 李東東

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

木霉菌(Trichoderma spp.)是在生物防治上應用最為廣泛的一類真菌。據(jù)文獻報道［1］，已有多種木霉菌用于真菌病害的生物防治，既包括土傳病害，又包括樹木枝干病害，都取得了相當不錯的防治效果。目前，生產(chǎn)上常用的木霉菌劑多為它的孢子制劑，將木霉發(fā)酵制成的孢子制劑進行種子包衣或土壤處理，可以有效地防治苗期病害。以色列Makhteshim Agan公司開發(fā)的以哈茨木霉T39菌株發(fā)酵液的生防制劑(Trichodex)為25%可濕性粉劑，可以用于防治灰霉病、苗枯病、霜霉病和白粉病等葉部病害及果實在儲藏期的腐爛［2］。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的特點是抗逆性強、活性高、生長快。本地種由于適應當?shù)貧夂颉⑺翖l件，施藥后能很快地在防治基體上生長，起到抑制“真菌病害”的作用［3－5］。但對于中國東北地區(qū)的嚴寒氣候，能夠應用在多種林木和農(nóng)作物上的木霉制劑還未見報道［6］。楊樹爛皮病是世界性的嚴重病害，主要為害楊、柳樹等闊葉樹的枝干，在我國東北、西北、華北等地廣泛發(fā)生，傳染性極強，嚴重時常導致林木大片死亡。由真菌引起的水稻稻瘟病(rice blast)是水稻上的一種極具毀滅性的病害，病原菌的無性世代為Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.，有性世代為 Magnaporthe grisea(Hebert)Bart。病菌在種子和稻草上越冬，播種后導致苗瘟，若氣溫在15℃以上又遇降水潮濕，病菌能夠迅速大量傳播，侵入稻株組織吸收養(yǎng)分，破壞細胞，在葉片上產(chǎn)生邊緣黃褐色、中央灰色的梭形病斑，隨后匯合成梭形條斑，葉片枯焦，影響水稻灌漿成熟。本文運用甲醇、乙醇、NaOH、超聲波4種方法對“本地種”哈茨木霉分生孢子進行提取，分別測定了各種提取物對楊樹爛皮病菌、水稻稻瘟病菌的抑制作用，從而找出提取分生孢子中抑菌活性物質的最佳溶劑與方法，為搞清木霉菌的生防機制和進一步開發(fā)木霉生物殺菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

哈茨木霉菌株分離自實驗室栽培食用菌灰樹花時染菌的菌袋。楊樹爛皮病菌(Cytosprora chrysosperma)采自大慶市林業(yè)局紅旗林場20年生的小黑楊樹林內(nèi)具有楊樹爛皮病斑的枝條，自行分離得到。水稻稻瘟病1號、2號菌株為黑龍江八一農(nóng)墾大學靳學慧教授惠贈。

1.2 菌種培養(yǎng)與分生孢子的收集

將哈茨木霉接種到直徑9 cm的PDA平板上，于25℃下培養(yǎng)7 d，產(chǎn)孢后用無菌水將分生孢子洗脫，配成1×107個孢子/mL的孢子懸浮液作為擴大培養(yǎng)菌種。在無菌條件下，將上述分生孢子懸浮液接種到裝入液體PDA培養(yǎng)基中，于28℃恒溫擴大培養(yǎng)，待長滿孢子后用無菌水將分生孢子洗脫，用兩層紗布過濾。取濾液于5 000 r/min離心30 min，收集沉淀物(分生孢子)供提取用。

1.3 抗菌物質提取

甲醇法:取10 g沉淀物，加入甲醇150 mL混勻振蕩，使分生孢子充分溶于甲醇中，在常溫下浸泡24 h，于3 000 r/min離心15 min，收集上清液，用旋轉蒸發(fā)器((60±1)℃)水浴減壓濃縮后，獲得膏狀提取物(記為A)供測定用。

乙醇法:取10 g沉淀物(分生孢子，下同)，加入150 mL 95%的乙醇混勻振蕩，使分生孢子充分溶于乙醇中，在常溫下浸泡24 h，于5 000 r/min離心15 min，棄沉淀物，收集上清液，按甲醇法減壓濃縮，獲得膏狀提取物(記為B)供測定用。

堿法:取10 g沉淀物，加入150 mL 1%的NaOH混勻振蕩，使分生孢子充分溶于溶液中，在常溫下浸泡24 h，于5 000 r/min離心15 min，棄沉淀物，收集上清液，按甲醇法減壓濃縮((70±1)℃)后，獲得膏狀提取物(記為C)供測定用。

超聲波水法:采用不同強度的超聲波破碎分生孢子及不同的提取次數(shù)提取抗菌物質。

①取10 g沉淀物，加入去離子水150 mL混勻振蕩，使分生孢子充分溶于水中，用超聲波粉碎儀將分生孢子細胞破碎(功率6 W，時間15 min)，于10 000 r/min離心30 min，棄沉淀物，收集上清液用旋轉蒸發(fā)器水浴減壓濃縮((50±1)℃)后，獲得膏狀提取物(記為D1)供測定用。

②取10 g沉淀物，加入去離子水150 mL混勻振蕩，使分生孢子充分溶于水中，用超聲波粉碎儀將分生孢子細胞破碎(功率4 W，時間5 min)，3 000 r/min離心15 min，分別收集沉淀物和上清液，上清液用旋轉蒸發(fā)器水浴減壓濃縮((50±1)℃)后，獲得膏狀提取物(記為D2)供測定用。

③取乙醇法收集的沉淀物，再加去離子水150 mL，用超聲波粉碎儀重復處理(方法同B)，3 000 r/min離心15 min，棄濾渣，取上清液用旋轉蒸發(fā)器水浴減壓濃縮((50±1)℃)后，獲得膏狀提取物(記為D3)供測定用。

1.4 提取物抑菌活性的測定

用無菌水將上述各種方法提取的提取物分別稀釋成 100(A1、B1、C1、D11、D21、D31)、1000(A2、B2、C2、D12、D22、D32)倍母液，用細菌過濾器過濾，取培養(yǎng)7d的楊樹爛皮病菌、稻瘟病1號、2號菌株菌餅(直徑5 mm)各1塊接種于平板中央，將濾液150 μL滴加到菌餅上，置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)，每處理3次重復，以滴加150 μL無菌水為對照。5 d后用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，并按下式計算抑菌率。

2 結果與分析

2.1 哈茨木霉分生孢子提取物對楊樹爛皮病菌的影響

2.1.1 甲醇、乙醇和NaOH分生孢子提取物對楊樹爛皮病菌的抑制

用甲醇、乙醇和NaOH 3種溶劑對哈茨木霉分生孢子進行提取，得到的抑菌結果見表1。方差分析結果(表2)表明，各溶劑提取物對菌落生長抑制差異不顯著。從表1可以看出，對母液稀釋100倍處理的抑菌效果好于稀釋1 000倍的處理。其中將NaOH提取物稀釋100倍的抑菌效果最好，抑菌率為39.46%，而乙醇和甲醇提取物的抑菌效果較弱。

表1 不同溶劑與超聲波水法不同處理提取物對楊樹爛皮病菌的抑菌率

2.1.2 超聲波水法分生孢子提取物對楊樹爛皮病菌的抑制

用超聲波水法對哈茨木霉分生孢子進行提取，得到的抑菌結果見表1。方差分析結果(表2)表明，超聲波水法不同處理提取物對菌落生長抑制差異顯著。其中:D11的抑菌率最高，為43.42%;D32的抑菌率最低，為14.43%。

表2 不同溶劑與超聲波水法不同處理提取物對楊樹爛皮病菌落生長抑制方差分析結果

2.2 哈茨木霉分生孢子提取物對水稻稻瘟病菌1號、2號菌株的影響

2.2.1 甲醇、乙醇和 NaOH分生孢子提取物對1號、2號水稻稻瘟病菌的抑制

用甲醇、乙醇和NaOH對哈茨木霉分生孢子進行提取，得到的抑菌結果如表3。方差分析結果(表4)表明，各溶劑提取物對稻瘟病1號菌株的菌落生長抑制差異不顯著，對2號菌株的菌落生長抑制差異顯著。從表3可以看出:對母液稀釋100倍處理的抑菌效果明顯好于稀釋1 000倍的處理，其中將甲醇提取物稀釋100倍對1號菌株的抑菌效果最好，抑菌率為35.78%，而乙醇和NaOH的提取物對1號菌株的抑菌效果較弱;將乙醇提取物稀釋100倍對2號菌株的抑菌效果最好，抑菌率為18.52%，而甲醇和NaOH的提取物對2號菌株的抑菌效果較弱。

表3 不同溶劑與超聲波水法不同處理提取物對水稻稻瘟病菌1號、2號菌株的抑菌率

表4 不同溶劑提取物對稻瘟病1號、2號菌株菌落生長抑制的方差分析結果

2.2.2 超聲波水法分生孢子提取物對水稻稻瘟病菌1號、2號菌株的抑制

用超聲波水法對哈茨木霉分生孢子進行提取，得到的抑菌結果見表3。從表3可以看出，D1提取物稀釋100倍對1號和2號菌株的抑菌率均最高，分別為42.81%和31.99%。方差分析結果(表5)表明，超聲波水法不同處理提取物對1號、2號菌株菌落生長抑制的差異都不顯著。

表5 超聲波水法不同處理提取物對稻瘟病1號、2號菌株菌落生長抑制的方差分析結果

3 結論與討論

目前，防治植物病原菌的木霉菌劑多以分生孢子為主要成分，而對分生孢子抑菌活性物質的提取，有助于深入了解分生孢子防病的機制。本文采用甲醇、乙醇、NaOH等溶劑和不同強度及不同提取次數(shù)的超聲波破碎法對哈茨木霉分生孢子進行了抗菌物質提取，用不同提取物分別對楊樹爛皮病菌、水稻稻瘟病菌進行了抑菌試驗。目的是找出提取分生孢子中抑菌物質的最佳溶劑與方法，為進一步開發(fā)木霉生物殺菌劑奠定基礎。試驗結果表明，無論是抑制楊樹爛皮病菌還是水稻稻瘟病菌，提取抑菌物質的最佳方法均為超聲波水法的第一種處理，它能夠獲得抑菌效果最強的活性物質。D1提取物稀釋100倍后對楊樹爛皮病菌的抑菌率仍高達43.42%，對水稻稻瘟病菌1號、2號菌株的抑菌率也分別高達42.18%和31.99%。超聲波水法提取物抑菌率的方差分析結果表明:處理楊樹爛皮病菌時，3種超聲波水法提取物差異顯著;處理2個水稻稻瘟病菌菌株時都不顯著。在3種不同溶劑分生孢子提取物的抑菌試驗中，將NaOH提取物稀釋100倍后對楊樹爛皮病菌的抑菌率相對較高，為39.46%，而甲醇和乙醇提取物的抑菌效果較弱，分別為10.60%和13.44%;將甲醇提取物稀釋100倍后對水稻稻瘟病菌1號菌株的抑菌率相對較高，為35.78%;將乙醇提取物稀釋100倍后對水稻稻瘟病菌2號菌株的抑菌率相對較高，為18.52%。3種不同溶劑分生孢子提取物抑菌率的方差分析表明，水稻稻瘟病菌2號菌株的菌落生長抑制差異較顯著。

［1］楊合同，唐文華，Ryder M.木霉菌與植物病害的生物防治［J］.山東科學，1999，12(4):7－15.

［2］Rabeendran N，Jones E E，Moot D J，et al.Biocontrol of Sclerotinia lettuce drop by Coniothyrium minitans and Trichoderma hamatum［J］.Biological Control，2006，39(3):352－362.

［3］辛雅芬，商金杰，高克祥.拮抗木霉菌的生防機制研究進展［J］.東北林業(yè)大學學報，2005，33(4):88－91.

［4］于新，田淑慧，徐文星，等.木霉菌生防作用的生化機制研究進展［J］.中山大學學報:自然科學版，2005，44(2):86－90.

［5］Song Xiaoyan，Shen Qingtao，Xie Shutao，et al.Broad-spectrum antimicrobial activity and high stability of Trichokonins from Trichoderma koningii SMF2 against plant pathogens［J］.FEMS Microbiology Letters，2006，260(1):119－125.

［6］Washington O，Michael J，Aad T.Effect of Infesting soil with Trichoderma harzianum and amendment with coffee pulp on survival of Armillaria［J］.Biological Control，2003，26(3):293－301.