鄭唐春 施曉文

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)(吉林省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院)

臧麗娜 朱銀鳳 王亞軍 曲冠證

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué)))

鋅指基因是一類廣泛研究的抗逆相關(guān)基因，廣泛分布在動物、植物和微生物中［1］。鋅指蛋白的共同特征是蛋白質(zhì)通過與Zn2+的結(jié)合，使自身折疊成指狀的多肽結(jié)構(gòu)。鋅指蛋白通過與靶分子DNA、RNA、DNA－RNA的序列特異性結(jié)合，以及與自身或其它鋅指蛋白的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)水平［2－3］。目前，利用反向遺傳學(xué)的方法探索基因的表達(dá)規(guī)律，研究基因功能的報(bào)道越來越多。擬南芥AT3G02790和AT5G16470基因被歸屬為鋅指基因家族，CLUSTALW程序分析結(jié)果表明，其核酸序列相似性達(dá)到81%，這兩個同源基因可能參與擬南芥植株的生長過程。本文以擬南芥AT3G02790和AT5G16470純合單突變株為親本(均為T－DNA插入突變體)，采用人工雜交技術(shù)獲得雜合子后，根據(jù)基因分離定律，結(jié)合PCR檢測技術(shù)，經(jīng)多輪PCR檢測后獲得純合雙突變株。并初步分析了純合雙突變株的表型，為下一步反向遺傳學(xué)探究該類鋅指基因功能提供試驗(yàn)材料，同時(shí)也表明用雜交技術(shù)獲得擬南芥多基因突變體是可行的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為從擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Centre，ABRC)購買的編號為CS－851718和SALK－091992擬南芥種子。通過篩選與擴(kuò)繁獲得AT3G02790和AT5G16470純合單突變的種子(原種為Columbia－0型)。rTaq酶、DNA marker、SYBR Premix EX TaqⅡ等PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司(中國大連)，EasyPure Plant RNA Kit購自全式金公司，其它試驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 擬南芥純合單突變的驗(yàn)證

種子置于濕潤濾紙上4℃春化處理3～4 d。用蘸濕的竹簽沾取單粒種子點(diǎn)播于經(jīng)高溫滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)(V(營養(yǎng)土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶1∶1)中，每株擬南芥約占3 cm×3 cm空間即可。放入生長室(22～23℃)中，相對濕度60% ～80%，每天16 h光照/8 h黑暗，光強(qiáng)約150 μmol/(m2·s)。3～4 d即可出芽。

半個月后擬南芥蓮座葉富集，摘取幾株突變株的蓮座葉用CTAB法［4］提取擬南芥總 DNA。以兩對引物:pBI121－Kan－F/pBI121－Kan－R;pDs－Lox－Hyg－F/pDs－Lox－Hyg－R(表 1)對單突變分別進(jìn)行驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系:擬南芥基因組DNA 1 μL;10×PCR Buffer 2.5 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;Primer－F(10 μmol/L)2 μL;Primer－R(10 μmol/L)2 μL;rTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，加 ddH2O 至終體積25 μL。反應(yīng)程序94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán);72℃ 7 min延伸。PCR結(jié)束后取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 擬南芥純合雙突變體的篩選

1.3.1 擬南芥的人工雜交

選取檢測過純合單突變的植株，待親本植株開花后，用鑷子將多余的花蕾移除，一般只保留最佳的花蕾5～6個。將花蕾(雜交母本)固定在解剖鏡視野的正中央，用解剖紙輕輕壓住花蕾，用鑷子除去母本的未開花的全部萼片、花瓣和雄蕊。第二天上午10:00左右從雜交父本上用鑷子摘取花藥，涂抹在柱頭上，授以父本的花粉，做好標(biāo)記。通常柱頭授粉10 h后柱頭毛開始萎蔫。3 d后種莢即伸長，據(jù)此判定雜交成功與否。雜交成功后，將母本植株的其它花蕾除去，雜交的種莢變黃時(shí)，收獲F1代種子。

1.3.2 擬南芥雜合體植株的驗(yàn)證

種植收獲的F1代種子，用CTAB法提取擬南芥總DNA，根據(jù)1.2中驗(yàn)證單突變的引物及其反應(yīng)體系的方法來驗(yàn)證F1代的基因型。對AT3G02790基因驗(yàn)證的PCR稱為PCR1，對AT5G16470基因驗(yàn)證的PCR稱為PCR2，如果兩輪PCR都能獲得目的條帶，則收獲驗(yàn)證后的雜合子植株的F2代種子。

1.3.3 擬南芥純合雙突變植株的篩選

種植收獲的F2代種子，隨機(jī)選擇120株雜合子栽種，用CTAB法提取擬南芥總DNA。用兩對引物:T－3－F/T－3－R;T－5－F/T－5－R(表 1)對雜合子分別進(jìn)行驗(yàn)證。對獲得的雜合子植株，先驗(yàn)證AT3G02790基因純合體的PCR稱為PCR3;對篩選出來的含AT3G02790基因純合體的植株再驗(yàn)證AT5G16470基因純合體的PCR稱為PCR4。PCR反應(yīng)體系:擬南芥基因組 DNA 1 μL;10×PCR Buffer 2.5 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;Primer－F(10 μmol/L)2 μL;Primer－R(10 μmol/L)2 μL;rTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，加 ddH2O 至終體積 25 μL。反應(yīng)程序94℃預(yù)變性 4 min;94℃變性 30 s，52℃(AT3G02790)或46℃(AT5G16470)退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)35個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR結(jié)束后取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 擬南芥AT3G02790/AT5G16470基因不同脅迫下的表達(dá)水平檢測

野生型擬南芥栽種45 d后，分別進(jìn)行如下處理:去離子水(Distilled Water)，300 mmol/L甘露醇，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L H2O2，100 μmol/L ABA(abscisic acid)溶液進(jìn)行澆灌處理及低溫(4℃)處理，分別處理 0、1、3、6、12、24 h 后，取適量擬南芥葉片用液氮冷凍處理并于－80℃下存放。用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒提取植株的總RNA，檢測純度和濃度后，以0.5 μg總RNA為起始材料，采用PrimeScript TM RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。將合成的第一鏈cDNA加去離子水稀釋10倍，用于定量RT－PCR反應(yīng)模板。用兩對引物AT3G－F/AT3G－R、AT5G－F/AT5G－R進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢驗(yàn)。反應(yīng)體系為:10 μL 2×SYBR premix Ex Taq、引物 Primer－F(10 μmol/L)、Primer－R(10 μmol/L)各1 μL和2 μL稀釋的各樣品的模板，加去離子水補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)在OPTIONⅡ熒光定量PCR儀上完成。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性12 s;57℃退火30 s;72℃延伸30 s;78.5℃讀板1 s，45次循環(huán)。用Actin基因(AT3G46520)作為內(nèi)參，內(nèi)參引物:Actin－F/Actin－R(表1)。用2－△△Ct方法進(jìn)行基因的相對定量分析［5］。

表1 PCR反應(yīng)引物匯總

1.5 擬南芥純合雙突變株的脅迫試驗(yàn)

將篩選出來的雙突變株收獲種子后，以野生型種子為對照。消毒后點(diǎn)種到不作處理的1/2MS、含有150 mmol/L NaCl或300 mmol/L甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，觀察種子的萌發(fā)情況和幼苗長勢。5 d后，再將未脅迫處理的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2MS、含有150 mmol/L NaCl或300 mmol/L甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，觀察突變株與野生型的表型差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥AT3G02790/AT5G16470基因序列分析

利用 NCBI數(shù)據(jù)庫中的 blastp程序發(fā)現(xiàn)AT3G02790基因和AT5G16470基因具有高度的相似性，一致性為81%(圖1，A)。在擬南芥中，這兩個基因被劃為C2H2型鋅指基因。但通過對Ex-PASy進(jìn)行Pfam表明，這兩個基因都不具備鋅指蛋白氨基酸序列的保守區(qū)域，這說明AT3G02790基因和AT5G16470基因并不屬于鋅指類基因，而是一種功能未知的基因。

通過PCR檢測獲得純合雙突變株，根據(jù)Tair(The Arabidopsis Information Resource)網(wǎng)站推斷的TDNA插入位置，結(jié)合RT－PCR檢測，得知T－DNA插入位置均在啟動子區(qū)域(圖1，B)。純合突變體植株中AT3G02790/AT5G16470基因的表達(dá)水平顯著降低(圖1，C)。

圖1 擬南芥AT3G02790/AT5G16470基因序列分析

2.1.1 擬南芥單突變植株的驗(yàn)證

將購買的編號為CS－851718和SALK－091992的擬南芥種子種植后提取總DNA，驗(yàn)證是否為突變株，為下一步人工雜交選取父本、母本。因?yàn)镃S－851718突變株的 T－DNA插入質(zhì)粒是 pDs－Lox，含有潮霉素抗性基因，SALK－091992突變株的 TDNA插入質(zhì)粒是proKII，含有卡那抗性基因，所以設(shè)計(jì)引物(表1)能擴(kuò)增出潮霉素基因(792 bp)(圖2，A)和卡那霉素基因(593 bp)(圖2，B)。

2.1.2 擬南芥雜合突變體的篩選

因?yàn)锳T3G02790/AT5G16470單突變體為純合體，所以雜交后獲得的是兩個基因的雜合突變株。將獲得的F1代雜交種子種植后，提取單株擬南芥總DNA，用方法1.2中的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來檢驗(yàn)雜合突變株。經(jīng)擴(kuò)增檢驗(yàn)，PCR1和PCR2分別能擴(kuò)增出長度為792 bp和593 bp的條帶，說明隨機(jī)選取的3株F1代植株全部為雜合體(圖3)。

圖2 擬南芥單突變株的PCR鑒定

圖3 F1代雜合子的篩選

2.1.3 擬南芥純合雙突變的篩選

根據(jù)T－DNA片段的兩端序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增檢驗(yàn)純合突變株。如果基因未被突變掉或者為雜合體的時(shí)候，能夠擴(kuò)增出目的條帶。如果為純合突變株，因?yàn)樵摶蛐蛄芯幋a區(qū)外源大片段的插入會阻抑目的基因特異擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，最終導(dǎo)致無法擴(kuò)增出目的條帶。本試驗(yàn)采用的PCR是在確定一個基因(AT3G02790)為純合突變體的基礎(chǔ)上再確定另一個基因(AT5G16470)為純合突變體。AT3G02790基因兩端長度為1000 bp，AT5G16470基因兩端的長度為500 bp。經(jīng)過PCR3反應(yīng)(圖4)，120株F2代中 16、17、19、20、21、27、30、32、36、39、40、42、43、44、46、47、52、53、55、57、58、60、61、67、69、70、71、72、78、79、80、84、86、87、90、92、93、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、110、114號未擴(kuò)增出條帶，或者條帶很淡，而野生型能檢測出亮帶，說明上述各株可能為AT3G02790基因純合突變株。然后用PCR4反應(yīng)驗(yàn)證(圖5)，純合單突變中的 27、30、43、70、78、93、94、99、101、103、105、106、107、114號仍未檢測出目的條帶，說明上述的幾株可能是純合雙突變株。

圖4 F2代純合單突變株(AT3G02790)的篩選

圖5 F2代純合雙突變株的篩選

2.2 擬南芥純合雙突變的表型觀察

純合雙突變體不同發(fā)育時(shí)期生長狀況的結(jié)果顯示，與野生型相比，在植物的生長發(fā)育過程中沒有明顯變化(圖 6)，說明在正常生長條件下，AT3G02790/AT5G16470基因的表達(dá)與表型無相關(guān)性。

2.3 擬南芥AT3G02790/AT5G16470基因不同脅迫下的表達(dá)水平檢測

用去離子水、甘露醇、NaCl、H2O2、ABA、低溫(4℃)分別處理擬南芥野生型植株，利用熒光定量PCR檢測AT3G02790和AT5G16470兩個基因的表達(dá)水平(表2、表3)。結(jié)果顯示，去離子水處理也能誘導(dǎo)兩個基因的表達(dá)。其中，H2O2能顯著誘導(dǎo)表達(dá)，并于24 h達(dá)到最高，說明其受氧化脅迫誘導(dǎo)。ABA同樣能顯著誘導(dǎo)AT3G02790和AT5G16470表達(dá)，于3 h達(dá)到最高，并隨處理時(shí)間的延長而逐漸降低。結(jié)果還表明，冷脅迫能顯著誘導(dǎo)AT5G16470基因表達(dá)，并在6 h達(dá)到較高。而甘露醇、NaCl也能在一定程度上促進(jìn)AT3G02790/AT5G16470的表達(dá)，并隨處理時(shí)間日的延長而逐漸升高。

圖6 擬南芥純合雙突變株的表型分析

表2 擬南芥AT3G02790基因在不同脅迫下的表達(dá)水平

表3 擬南芥AT5G16470基因在不同脅迫下的表達(dá)水平

2.4 擬南芥純合突變株的脅迫試驗(yàn)

純合突變株在150 mmol/L NaCl、300 mmol/L甘露醇培養(yǎng)基上發(fā)芽率比野生型稍低(表4)，但在萌發(fā)時(shí)間和長勢情況上未有顯著區(qū)別(圖7)。觀察幼苗在含NaCl、甘露醇培養(yǎng)基上側(cè)根的生長狀態(tài)，只有30#突變株在甘露醇脅迫下根伸長緩慢，但側(cè)根數(shù)量增加(圖7，I)。

表4 擬南芥純合雙突變株鹽、甘露醇脅迫的發(fā)芽率 %

圖7 擬南芥純合突變株的脅迫試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

擬南芥鋅指基因AT3G02790和AT5G16470分別位于(2n=10)第 3條(http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=35782＆type=locus)和第 5 條(http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=134268＆type=locus)染色體上。AT3G02790和AT5G16470基因在F1自交產(chǎn)生F2的過程中，符合孟德爾的獨(dú)立分離規(guī)律，即在減數(shù)分裂形成配子時(shí)，位于同源染色體上的每一對等位基因都發(fā)生分離，而位于非同源染色體上的非等位基因可以自由組合。F2代群體中共有9種基因型，在F1所產(chǎn)生的16種雌雄配子可能的組合方式中，僅有1種組合的基因型是純合子，因此，在F2群體中篩選出純合雙突變體的概率為1/16。為獲得純合的雙突變體，需要對F2代大量植株提取DNA進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，但由于在F2代群體中篩選純合的雙突變體需要做較多的PCR反應(yīng)體系，因此，在確定一個基因是純合突變的基礎(chǔ)上，需要再驗(yàn)證另一個基因是否為純合突變，這樣不僅能夠及時(shí)排除非目的植株，而且還可以節(jié)省PCR試劑。考慮到PCR方法自身的誤差，以及防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果，每次PCR反應(yīng)都用野生型做陰性對照［6－8］。雖然經(jīng)過自由組合后純合子出現(xiàn)的概率比較小，但擬南芥結(jié)種量很大，只要得到一株純合子，就可通過擴(kuò)繁得到足夠的種子。

通過人工雜交的方法獲得了鋅指基因AT3G02790/AT5G16470純合突變株，說明該方法對于獲得多基因植株是切實(shí)可行。對大量植株進(jìn)行篩選，經(jīng)過多輪PCR獲得了十幾個可能的純合突變株，結(jié)合RT－PCR檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)兩個基因均能微弱地表達(dá)。究其原因可能是因?yàn)檫@兩個基因的基因序列較短，只有300 bp左右，T－DNA片段未插入到基因的讀碼框中，而是插入到基因的上游啟動子序列內(nèi)(圖1B)。因?yàn)樯嫌螁幼訁^(qū)域的外源片段插入，在對突變株的DNA進(jìn)行PCR檢測時(shí)，延伸合成受阻，故而擴(kuò)增不出條帶;而RT－PCR是對轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，啟動子區(qū)域受阻后，基因表達(dá)受阻礙，檢測出突變體表達(dá)水平顯著降低。

初步研究表明，AT3G02790和AT5G16470基因受甘露醇、NaCl、H2O2、ABA、低溫(4 ℃)處理誘導(dǎo)表達(dá)，可能這兩個基因也參與一些特定的脅迫應(yīng)答。AT3G02790和AT5G16470基因熒光定量PCR結(jié)果和鋅指基因的研究結(jié)果有些相似。例如:胡椒鋅指基因CaAbsi1參與對氧化物、過氧化氫和脫落酸等產(chǎn)生脅迫應(yīng)答反應(yīng)［9］;菊花鋅指蛋白基因DgZFP在種子中可被NaCl、干旱、低溫(4℃)處理誘導(dǎo)，Dg-ZFP基因的過量表達(dá)還能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性［10］;擬南芥鋅指基因 AZF1、AZF2、AZF3 在干旱、高鹽、低溫(4℃)和外源ABA的處理后，表達(dá)量顯著增高［11］。雖然AT3G02790和AT5G16470純合突變體的表型結(jié)果顯示與野生型沒有差異，且甘露醇、NaCl脅迫試驗(yàn)結(jié)果不顯著，但并不能說明AT3G02790、AT5G16470基因與鋅指蛋白基因家族間沒有相互作用。CLUSTALW程序分析顯示，AT3G02790、AT5G16470基因與鋅指基因同源性高達(dá)81%，AT3G02790和AT5G16470基因在擬南芥中暫時(shí)被定義為鋅指基因。因?yàn)?AT3G02790和AT5G16470基因并沒有鋅指基因所特有的保守區(qū)域，故而推斷這兩個基因可能是功能未知的基因。AT3G02790/AT5G16470純合雙突變株的獲得，為研究這兩個基因的未知功能與相互作用提供了良好的試驗(yàn)思路，同時(shí)為下一步研究其同源基因過量表達(dá)分析奠定了材料基礎(chǔ)。

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