四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院 趙海霞 趙培培 陳 惠 吳 琦＊

膠原蛋白酶是可作用于膠原或變性明膠而不作用于其他蛋白質(zhì)的酶類(lèi)，其可以斷裂膠原蛋白，斷裂的碎片自動(dòng)變性，進(jìn)而被普通蛋白酶水解（Gallop和Seifter，1963）。 膠原蛋白酶對(duì)膠原蛋白的特異降解性，使其廣泛應(yīng)用于飼料工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)和化工等領(lǐng)域。膠原酶包括動(dòng)物源膠原酶和微生物源膠原酶。目前報(bào)道的膠原酶產(chǎn)生菌主要有Bacillus pumilus（吳琦等，2007）、Bacillus licoeniformis （Asdornnithee 等 ，1994），Bacillus sp. （Nakayama 等 ，2000）、Borrelio burgdorferi （Grab 等，1996）、Streptococcus gordonii（Juarez 和 Stinson，1999）和 Clostridum perfringens（Matsushita等，1994）。本研究從土樣中篩選到一株膠原蛋白酶產(chǎn)生菌，經(jīng)試驗(yàn)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescen），以期為進(jìn)一步的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 雅安市畜肉市場(chǎng)和污水口等處采集土樣和水樣。

1.1.2 主要藥品及試劑 引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；rTaq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA Ligase、pMD18-T Vector凝膠回收試劑盒、DNA MarkerVII、蛋白質(zhì)Marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素（100 μg/mL），酸性 Ⅲ 型 膠 原 蛋 白 （Sigma 公 司 ），NaCl、HgCl、NaOH、濃HCl、胰蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、K2HPO4·3H2O、蔗糖、MgCl2、聚乙二醇 20000、瓊脂粉、瓊脂糖和Tris等。

1.1.3 培養(yǎng)基 按照楊光垚等 （2004）配置培養(yǎng)基。 種子培養(yǎng)基（1000 mL）：牛肉膏 5 g，NaCl 5 g，蛋白胨 10 g，pH 7.2 ～ 7.4；富集培養(yǎng)基（1000 mL）：明膠 1 g，NaCl 5 g， 蛋白胨 5 g，pH 7.2 ～ 7.5；初篩培養(yǎng)基（1000 mL）：明膠 20 g，NaCl 0.1 g，蛋白胨 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH 7.2 ～7.5；復(fù)篩培養(yǎng)基（1000 mL）：葡萄糖 20 g，酵母粉1.5 g， 胰蛋白胨 10 g，CaC120.05 g，NaH2PO4·2H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g，pH 7.0 ～ 7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

1.2.1.1 富集培養(yǎng) 取樣品2 g或2 mL，用生理鹽水18 mL浸泡搖勻后放置10 min，在沸水浴中處理5 min，冷卻后按0.5%的量取懸浮液接種于裝有富集培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min，37℃搖瓶培養(yǎng)2 d。

1.2.1.2 膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的初篩 將富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋至 10-6，10-7，10-8三個(gè)梯度，各取50 μL進(jìn)行涂布初篩平板，涂布均勻后放入37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌落生長(zhǎng)情況，選取具有隱約透明圈的菌落，轉(zhuǎn)接平板，編號(hào)記錄。將初篩菌在37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，在平板菌落周?chē)渭铀嵝怨噭渲車(chē)霈F(xiàn)透明圈者為陽(yáng)性。挑選明膠水解圈與菌落直徑比值較大的菌株保存。1.2.1.3 牛皮消化試驗(yàn) 挑選明膠水解圈與菌落直徑比值較大的菌株，分別接種于種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 d。剪取約0.5 g重的新鮮小牛皮，滅菌后裝入試管，每管加入種子培養(yǎng)基上清液各2 mL（4000 r/min 離心 10 min），并標(biāo)上對(duì)應(yīng)的號(hào)，另取一管加入2 mL無(wú)菌種子培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，蓋上棉塞，室溫放置2 d，每12 h搖動(dòng)一次，以便牛皮與酶液充分接觸。兩天后取出牛皮進(jìn)行對(duì)照觀察。

1.2.2 膠原蛋白酶活性檢測(cè) 采用茚三酮顯色法，以Ⅲ型膠原蛋白作為底物，測(cè)定反應(yīng)所釋放的水溶性氨基酸、短肽，以甘氨酸顯色制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力單位定義為：在37℃，pH7.5條件下，1 mL酶液每分鐘水解膠原產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol甘氨酸的量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 生理生化鑒定 根據(jù)分離菌的菌落和菌體形態(tài)，芽孢的有無(wú)和著生情況，革蘭氏染色以及生理生化反應(yīng)，按《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步分類(lèi)（東秀珠和蔡妙英，2001）。

1.2.3.2 16S rDNA的擴(kuò)增與序列分析 將菌種接種于20 mL/150 mL種子培養(yǎng)基，37℃ 180 r/min培養(yǎng)12 h，采用革蘭氏陽(yáng)性菌DNA out抽提試劑盒 （天澤基因工程有限公司）提取菌株總DNA。

上 游 引 物 序 列 （27F）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG， 下游引物序列 （1492R）：TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT。 PCR 反應(yīng)體系 （25 μL）為：10×buffer2.5 μL，25 μM 的 MgCl20.5 μL，2.5 mM dNTP0.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，總 DNA0.5 μL，5 U/μL 的 rTaq DNA 聚 合酶 0.5 μL，超純水18.5 μL。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)T載體克隆后，送上海英駿 （invitrogen）生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果采用Blasting程序，與GenBank（http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，進(jìn)行分子遺傳學(xué)鑒定（龍?chǎng)┖完惔嫔纾?006）。

2 結(jié)果

2.1 膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及牛皮消化試驗(yàn)

經(jīng)富集培養(yǎng)后，梯度稀釋涂布于初篩平板上，確定具有明膠水解活性的菌株。初篩菌株經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取上清液對(duì)新鮮小牛皮進(jìn)行室溫消化，從中篩選對(duì)牛皮消化效果好的菌株。結(jié)果表明，菌株Col-C的培養(yǎng)液能在48 h內(nèi)對(duì)犢牛皮有消化作用，牛皮明顯變薄，而陰性對(duì)照組牛皮無(wú)明顯變化（見(jiàn)圖1）。因此，菌株Col-C能分泌膠原蛋白酶，且具有較強(qiáng)消化牛皮的能力。

圖1 牛皮消化試驗(yàn)

2.2 膠原蛋白酶活力測(cè)定 采用茚三酮顯色法測(cè)定膠原蛋白酶活力，顯色后在570 nm處測(cè)光密度吸收值，測(cè)得Col-C的膠原蛋白酶活力達(dá)到21.19 U/mL。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 挑取該菌接于初篩平板上37℃培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形，凸出平板。邊緣整齊，表面光滑，有亮澤。無(wú)褶皺，具有粘性，不透明，邊緣呈乳白色，菌落中間呈現(xiàn)粉紅色。滴加酸性汞試劑后，在菌落周?chē)梢?jiàn)明顯透明水解圈，透明水解圈直徑與菌落直徑之比約為3.1∶1。光學(xué)顯微鏡下觀察，該菌為革蘭氏陰性菌，菌的大小約0.5 μm×（0.5 ～ 1.0）μm，周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)莢膜，無(wú)芽胞。

2.3.2 生理生化鑒定 菌株Col-C的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)形態(tài)學(xué)及生理生化培養(yǎng)特性比較，參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，將菌株Col-C初步鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescen）。

表1 菌株Col-C的生化培養(yǎng)特性鑒定結(jié)果

2.3.3 16S rDNA的擴(kuò)增和序列分析驗(yàn) 采用16S rDNA特異引物對(duì)菌株Col-C的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.5 kb的單一擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖2。經(jīng)T載體克隆，進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，擴(kuò)增片段長(zhǎng)1507 bp，具有典型的16S rDNA特征。采用Blasting，將該序列與GenBank的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明，比對(duì)擊中近10條同源率高的序列，該序列與粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescen）16S rDNA同源性為99%。因此，將此具有膠原蛋白酶活性的菌株Col-C鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescen）。

圖2 菌株Col-C 16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

皮革蛋白粉飼料，是以制革工業(yè)的廢料（鉻革渣）為原料，經(jīng)過(guò)水解與脫鉻及熟化、干燥、粉碎等工藝加工而成的一種高蛋白質(zhì)飼料（趙玉蓉等，2003）。在飼料中適量添加可以替代部分魚(yú)粉用于節(jié)省飼養(yǎng)成本（付京花和唐雪蓮，2011）。目前，國(guó)內(nèi)已有報(bào)道應(yīng)用于育肥豬 （仔豬）（黃國(guó)發(fā)和邸平勝，2006；邸平勝和白生貴，2006；王九峰等，1998）、蛋雞（范貽洋，1989；張修全，1987）和草魚(yú)（趙玉蓉等，2003）等的飼養(yǎng)中。但由于膠原蛋白為硬蛋白，動(dòng)物消化道難以真正做到有效消化吸收。因此，如果添加適量膠原蛋白酶，一方面可以解決膠原蛋白有效消化的問(wèn)題，還可以適當(dāng)增加皮革蛋白在飼料中的添加量，進(jìn)一步降低飼料成本。

膠原蛋白酶可通過(guò)動(dòng)物內(nèi)臟提取或微生物發(fā)酵獲得。由于微生物來(lái)源的膠原酶較動(dòng)物膠原酶作用底物廣、對(duì)底物作用位點(diǎn)多、可通過(guò)發(fā)酵大量獲得等優(yōu)點(diǎn)，而動(dòng)物膠原酶含量少、成本高、不易提取，因而研發(fā)微生物來(lái)源的膠原酶具有現(xiàn)實(shí)意義。本文從土壤中篩選到的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescen）天然酶活為21.19U/mL，具有較高的研究?jī)r(jià)值。

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