張旭浩 焦海展 吳亞冉 張凱峰 門麗慧 趙 青 韓 博 鞏春玲 叢中一

(吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130021)

調(diào)查結(jié)果表明老年人(≥65歲)占結(jié)直腸癌病人的54.00%，老年人直腸癌和結(jié)腸癌發(fā)病率分別為49.81/10萬和63.35/10萬，為結(jié)直腸癌的高發(fā)人群〔1〕，所以結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療對于人類的健康特別是對于老年人至關(guān)重要。研究表明，結(jié)直腸癌缺失(DCC)基因的缺失可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而DCC基因的表達(dá)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面具有重要作用;同時(shí)，有報(bào)道17p和18q基因在遠(yuǎn)地轉(zhuǎn)移腫瘤中缺失的幾率很高且可以看到多對等位基因片段的缺失〔2〕。本實(shí)驗(yàn)主要研究DCC基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 氨芐青霉素、卡那霉素購自北京華美生物工程公司;細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨及酵母提取物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自GIBCO公司;Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116由本室保存;pIRES2-EGFP質(zhì)粒以及含有DCC基因胞內(nèi)功能域(3 727～3 792 bp)的重組表達(dá)載體pIRES2-EGFP-DCC為本實(shí)驗(yàn)室保存;TUNEL試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SW1116細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含有10%FBS、100 U/ml青/鏈霉素)，0.25%胰酶消化、傳代。

1.3 pIRES2-EGFP-DCC脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞 將SW1116細(xì)胞按5×103/孔接種于96孔板，分為3組(實(shí)驗(yàn)組、質(zhì)粒對照組、細(xì)胞對照組)，每組6個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁并生長至占板底面積40% ～50%，將4μl Lipofectamine 2000與96μl無雙抗無血清培養(yǎng)基混合，室溫孵育5 min。然后將pIRES2-EGFP-DCC與pIRES2-EGFP各2μl與48μl無雙抗無血清培養(yǎng)基混合，分別加入上述 Lipofectamine 2000稀釋液50μl，混合，37℃孵育10 min。實(shí)驗(yàn)組96孔板每孔加入 Lipofectamine 2000和pIRES2-EGFP-DCC混合液10μl，24孔板每孔加入100μl;質(zhì)粒對照組96孔板每孔加入Lipofectamine 2000和pIRES2-EGFP混合液10μl，24孔板每孔加入100μl。5 h后換無雙抗有血清培養(yǎng)液，細(xì)胞對照組不做處理。

1.4 四甲基耦氮唑鹽(MTT)比色法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況轉(zhuǎn)染36 h后，于每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)。于37℃孵育4 h后棄掉培養(yǎng)液，加入150μl DMSO，搖床震蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm每孔吸光度OD值。記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/細(xì)胞對照組OD值)×100%。

1.5 吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況轉(zhuǎn)染36 h后，于每孔加入AO、EB的等體積混合液2μl，室溫避光染色10 min，激發(fā)波長510 nm，熒光顯微鏡下照相觀察。鏡下隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)的視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中凋亡及壞死細(xì)胞，分別計(jì)算細(xì)胞凋亡率及壞死率。

1.6 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染36 h后，方法按稍加修改的TUNEL檢測試劑盒說明書進(jìn)行，使用TUNEL原位檢測試劑盒對凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，參數(shù)統(tǒng)計(jì)采用異方差t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖情況 實(shí)驗(yàn)組、細(xì)胞對照組、質(zhì)粒對照組的細(xì)胞增殖分別為0.599±0.037，0.735±0.031，0.675±0.020，可見轉(zhuǎn)染 pIRES2-EGFP-DCC 36 h后，MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染DCC基因功能區(qū)對SW1116細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，抑制率為32.1%，三組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 AO/EB染色法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-DCC 36 h后，AO/EB熒光染色結(jié)果如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組中可見大量激發(fā)黃色熒光的凋亡晚期細(xì)胞，而質(zhì)粒對照組和細(xì)胞對照組中基本沒有，表明轉(zhuǎn)染DCC基因功能區(qū)可以明顯誘導(dǎo)SW1116細(xì)胞凋亡。

2.3 TUNEL法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況 TUNEL法結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中可見大量被染成棕褐色的凋亡細(xì)胞，而質(zhì)粒對照組和細(xì)胞對照組中基本沒有，見圖2。表明DCC基因功能區(qū)的表達(dá)可以明顯誘導(dǎo)SW1116細(xì)胞凋亡。

圖1 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-DCC的SW1116細(xì)胞AO/EB染色熒光照片(×100)

圖2 轉(zhuǎn)染p IRES2-EGFP-DCC的SW1116細(xì)胞TUNEL檢測照片(×200)

3 討論

DCC基因是Fearon等〔3〕在研究結(jié)直腸腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)抑癌基因，編碼由1 447個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，其胞外區(qū)為神經(jīng)生長因子-1(Netrin-1)受體，胞內(nèi)區(qū)含有324個(gè)氨基酸，氨基端有25個(gè)疏水性氨基酸構(gòu)成的信號序列，緊接著信號序列之后是4個(gè)免疫球蛋白樣C2結(jié)構(gòu)域，之后便是6個(gè)Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域。該基因定位于18號染色體長臂(18q21.3)。

研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中DCC基因缺失率在70%以上〔4〕;Gal等〔5〕在其研究中發(fā)現(xiàn)，對于 DCC 蛋白表達(dá)陽性的病人，當(dāng)輔助于化療時(shí)，可使生存率大大提高。將DCC反義RNA轉(zhuǎn)染纖維母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞生長失控，體內(nèi)注射對裸鼠具有致瘤性〔6〕。將DCC基因轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞生長受到抑制，體內(nèi)注射對裸鼠的致瘤性降低〔7，8〕。這些研究表明，DCC基因的表達(dá)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

隨后Mazelin等〔9〕發(fā)現(xiàn)，DCC對腫瘤的抑制作用是通過有條件誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。Mehlen等〔10〕研究表明，DCC蛋白是一種依賴性受體，在配體Netrin-1存在時(shí)則具有抗凋亡作用，在配體缺乏時(shí)可以誘導(dǎo)凋亡。Mehlen等〔10〕進(jìn)一步將DCC胞內(nèi)區(qū)(DCC-IC)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Caspases活性明顯增加;體外Caspases孵育實(shí)驗(yàn)表明，DCC-IC在1 290 bp處被Caspases斷裂;將斷裂位點(diǎn)區(qū)域DCC-IC/1 121～1 290轉(zhuǎn)染293T可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;進(jìn)一步體外突變研究發(fā)現(xiàn)DCC-IC/1 243～1 264區(qū)段對于誘導(dǎo)凋亡是必需的。這些研究表明，DCC蛋白的腫瘤抑制作用是通過在配體Netrin-1缺乏時(shí)經(jīng)Caspases通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，而且其活性功能域很可能就是DCC-IC/1 243～1 264。DCC基因失活導(dǎo)致Bcl-2/Bax反常表達(dá)，抑制凋亡發(fā)生，可作為DCC基因凋亡分子機(jī)制之一〔11〕。

本研究通過脂質(zhì)體法將含有DCC基因胞內(nèi)區(qū)功能域(3 727～3 792 bp)的重組表達(dá)載體pIRES2-EGFP-DCC轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116，轉(zhuǎn)染目的片段的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比細(xì)胞增殖明顯受到抑制;且實(shí)驗(yàn)組通過AO/EB法和TUNEL法分別檢測到大量凋亡細(xì)胞，而對照組沒有，證明該片段具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，為進(jìn)一步研究DCC基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

1 Lei T，F(xiàn)ang L，Cheng WQ，et al.Analysis of epidemiological characteristics and trends of colorectal cancer among elderly patients in ten cities and counties in China〔J〕.Disease Surveillance，2009;24(6):429-33.

2 Reale MA，Hu G，Zafar AL，et al.Expression and alternative splicing of the deleted in colorectal cancer(DCC)gene in normal and malignant tissues〔J〕.Cancer Res，2007;54:4493-501.

3 Fearon ER，Cho KR，Nigro JM，et al.Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers〔J〕.Science，1990;247(4938):49-56.

4 Vogelstein B，F(xiàn)earon ER，Hamilton SR，et al.Genetic alterations during colorectal-tumor development〔J〕.N Engl JMed，1988;319:525-32.

5 Gal R，Sadikov E，Sulkes J，et al.Deleted in colorectal cancer Protein expression as a possible Predictor of response to adjuvant chemotherapy in colorectal cancer patients〔J〕.Dis Colon Rectum，2004;47(7):1216-24.

6 Narayanan R，Lawlor KG，Schaapveld RQ，et al.Antisense RNA to the putative tumor-suppressor gene DCC transforms Rat-1 fibroblasts〔J〕.Oncogene，1992;12:1387.

7 Goyette MC，Cho K，F(xiàn)asching CL，et al.Progression of colorectal cancer is associated with multiple tumor suppressor gene defects but inhibition of tumorigenicity is accomplished by correction of any single defect via chromosome transfer〔J〕.Mol Cell Biol，1992;12:1387-95.

8 Tanaka K，Oshimura M，Kikuchi R，et al.Suppression of tumorigenicity in human colon carcinoma cells by introduction of normal chromosome 5 or 18〔J〕.Nature，1991;349:340-2.

9 Mazelin L，Bernet A，Bonod-Bidaud C，et al.Netrin-1 controls colorectal tumorigenesis by regulating apoptosis〔J〕.Nature，2004;431(7004):80-4.

10 Mehlen P，Rabizadeh S，SniPas SJ，et al.The DCCgene product induces apoptosis by a mechanism requiring receptor proteolysis〔J〕.Nature，1998;395:801.

11 楊 莉，孫明軍.DCC基因失活與大腸癌發(fā)病及與Bcl-2、Bax表達(dá)的相關(guān)性研究〔D〕.沈陽:中國醫(yī)科大學(xué)碩士論文，2007.