史美龍

(吉林省人民醫(yī)院基本外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

Survivin基因?qū)儆诘蛲鲆种苹蚣易?，Survivin蛋白在人結(jié)腸癌組織以及細(xì)胞株中均顯著高表達(dá)，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及血管形成有關(guān)，已成為具有潛在價(jià)值的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物和腫瘤治療的新靶點(diǎn)〔1，2〕。本課題前期構(gòu)建了靶向干擾Survivin的小發(fā)卡RNA(shRNA)，并對(duì)Survivin基因沉默后結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖〔3，4〕。在前期研究工作的基礎(chǔ)上，本研究利用已經(jīng)構(gòu)建成功的重組載體，探討Survivin基因沉默后垂體瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG)mRNA的表達(dá)，旨在為闡明Survivin在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及基因治療的應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 結(jié)直腸癌Lovo細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipo2000購(gòu)自Invitrogen公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Promega公司。重組質(zhì)粒pGenesil-2-對(duì)照(非同源干擾序列插入pGenesil-2)和pGenesil-2-Survivin 1(插入靶向Survivin基因5'-GGACCACCG CATCTCTACA-3'目的片段干擾序列的pGenesil-2干擾載體)以及pGenesil-2-Survivin 2(插入靶向Survivin基因5'-GGCTGGCTTCATCCACTGC-3'目的片段干擾序列的pGenesil-2干擾載體)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 質(zhì)粒抽提 將本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGenesil-2-對(duì)照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin 2接種于50 ml LB培養(yǎng)液中，37℃、250 r/min振搖培養(yǎng)16 h。運(yùn)用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 運(yùn)用含10%胎牛血清在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Lovo細(xì)胞。將細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度約為5×105個(gè)/孔。運(yùn)用脂質(zhì)體Lipo 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil-2-對(duì)照、pGenesil-2-Survivin 1 和 pGenesil-2-Survivin 2，轉(zhuǎn)染方法按照Lipo2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 于轉(zhuǎn)染后0、24、48和72 h收集細(xì)胞，運(yùn)用Trizol法按照操作說(shuō)明書(shū)提取總RNA(購(gòu)自北京百泰克生物科技有限公司)，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自Fermentas公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。特異性引物用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Survivin和PTTG的表達(dá)。Survivin引物:上游:5'-GCCAGATTTGAATCGCGGGA-3';下 游:5'-GCAGTGGATGAAGCCAGCCT-3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為185 bp。PTTG引物:上游:5'-AGTTTCAACCACGTTTTGGC-3';下游:5'-CTTTTCAAGCT CTCTCTCCT-3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為352 bp。管家基因GAPDH引物，上 游:5'-CCAATATGATTCCACCCATG-3';下 游:5'-GAGAAGGCTGGGG CTCATTT-3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為195 bp，引物由上海英俊生物有限公司合成。

20μl反應(yīng)體系中含 cDNA樣品2.0μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μl，上、下游引物(20 pmol/μl)各0.2 μl，去離子水補(bǔ)足20μl。Eppendorf實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上設(shè)置95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照。將 cDNA 液按101、102、103和104、105梯度稀釋后，各取2μl進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)目的基因和GAPDH的擴(kuò)增效率，Ct值為熒光信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)設(shè)置的閾值強(qiáng)度時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)。采用比較循環(huán)閾值法(2-ΔΔCt)分析樣本中Survivin和PTTG的相對(duì)含量〔5〕。具體計(jì)算方法如下:以加入Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑組作為正常對(duì)照，分別將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil-2-對(duì)照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin 2與正常對(duì)照組做比較，得倍數(shù)為 N(N=2-ΔΔCt)，其中 ΔΔCt= ΔCt(重組質(zhì)粒)-ΔCt(正常對(duì)照)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，各組之間的差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及Ct值測(cè)定 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因cDNA片段，熒光量的增長(zhǎng)曲線符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”形熒光增長(zhǎng)曲線，3個(gè)復(fù)孔實(shí)時(shí)熒光值曲線擬合良好，指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)即循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)接近，陰性對(duì)照Ct值趨于0;熔解曲線集中，峰值高尖平滑，表明實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系穩(wěn)定，模板分配均勻，引物無(wú)二聚體形成，結(jié)果可靠。以不同起始濃度模板(分別為101、102、103、104、105)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系大于98%，擴(kuò)增效率均大于95%，可以用2-ΔΔCt法對(duì)比Survivin和PTTG mRNA在不同組的表達(dá)差異。

2.2 Survivin和PTTG mRNA在不同組的表達(dá) Lovo細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil-2-對(duì)照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin2后，Survivin mRNA表達(dá)情況見(jiàn)表1，PTTG mRNA表達(dá)情況見(jiàn)表2。Survivin基因沉默后24～72 h，與正常對(duì)照組相比，Survivin mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，表明干擾效果可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要。Survivin基因沉默后24～72 h后，PTTG mRNA表達(dá)較相同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，其中，24和48 h后，pGenesil-2-Survivin 1組和 pGenesil-2-Survivin 2組PTTG mRNA表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間Survivin mRNA表達(dá)情況(x ± s，n=6)

表2 各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間PTTG mRNA表達(dá)情況(x ± s，n=6)

3 討論

Survivin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族新成員，是有絲分裂及程序性細(xì)胞死亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其功能不僅局限于抑制細(xì)胞凋亡，而且能夠調(diào)節(jié)有絲分裂的紡錘體關(guān)卡，參與腫瘤血管形成及腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。Survivin主要表達(dá)于黏膜層腺體底部，結(jié)腸癌組織及細(xì)胞株中顯著增高，而且與腫瘤分化程度明顯相關(guān)，是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期事件〔6〕。邢洪存等〔7〕檢測(cè)58例結(jié)直腸癌組織及其鄰近的正常組織中Survivin基因mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Survivin基因mRNA在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯增高，并與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。PTTG是一種新型原癌基因，該基因位于人類(lèi)第5號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)3帶(5q33)，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，作用是通過(guò)抑制分裂酶的活性抑制成熟前的染色體分裂，參與生命的多個(gè)關(guān)鍵進(jìn)程，如細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞周期的進(jìn)行、細(xì)胞凋亡及DNA修復(fù)等。Heaney等〔8〕運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)了48例結(jié)腸癌和20例結(jié)腸息肉患者中PTTG mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌和結(jié)腸息肉中PTTG mRNA的平均含量都是正常結(jié)腸黏膜的2.2倍。由于Survivin和PTTG mRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)均明顯增高，并且有望作為潛在的結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)，提示兩者可能存在一定的關(guān)聯(lián)性，相互促進(jìn)共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)病。

本研究表明Survivin可能與PTTG相互聯(lián)系參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。然而，Survivin與PTTG相互關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。相信隨著研究的不斷深入，Survivin與PTTG將會(huì)在結(jié)直腸癌的基因治療中展示出更大的價(jià)值。

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3 史美龍.Survivin特異性shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及評(píng)價(jià)〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(11):1352-3.

4 史美龍.Survivin基因小干擾RNA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(14):1733-5.

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7 邢洪存，郭芳芳，盧振霞.Survivin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥指南，2010;28(8):24-6.

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