賀霄羽，熊鶯，孫 午

(1、南昌市三三四醫(yī)院,江西 南昌 330024；2、九江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西 九江 332000)

肺癌是常見的導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤之一，在我國肺癌死亡占癌癥死亡病因的第3 位，且發(fā)病率有逐年增加的趨勢。肺癌分為小細(xì)胞肺癌(SCLC，15%～25%)和NSCLC(NSCLC，75%～85%)，而NSCLC 占到原發(fā)肺癌的80%～85%。肺癌是一種多基因遺傳病，目前已發(fā)現(xiàn)很多NSCLC 相關(guān)基因，如RAS 基因家族、MYC 基因家族、ERBB 基因家族、P53、RB等[1]，研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)眾多免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的多種生長因子和細(xì)胞因子在正常組織內(nèi)不表達(dá)或痕量表達(dá)，而在腫瘤尤其是惡性腫瘤有表達(dá)。本研究可推測NSCLC 患者外周血中檢測到IL-13Rα2 蛋白的表達(dá)。IL-13Rα2 基 因(IL13RΑ2)位于Xq13.1-q28，共有九個外顯子，其中第七外顯子上有一個cSNPs(rs17095919)，我們已知雖然吸煙是肺癌發(fā)病的高風(fēng)險因素，但只有10%～15%的吸煙者最終發(fā)展成為肺癌，說明了個體基因差異性對肺癌的易感性起了重要作用。本實(shí)驗(yàn)主要研究這個cSNPs 是否與NSCLC 易感性相關(guān)，為NSCLC 早期診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 550型號微孔板酶標(biāo)儀(伯樂太平洋有限公司)；Real-time PCR 試劑(全式金公司)；ELISA試劑盒(美國R&D 公司)；實(shí)時熒光定量PCR 儀(達(dá)安7600)；生物安全柜(復(fù)星公司)。

1.2 方法 50例原發(fā)性肺癌患者為2011年3月至2012年3月在南昌市三三四醫(yī)院和九江市第一人民醫(yī)院胸外科進(jìn)行手術(shù)治療的患者，術(shù)前未行化療和放療，所有的標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)確診為原發(fā)性肺癌。50個無腫瘤病史和體征的正常對照隨機(jī)選自江西地區(qū)例行體檢的健康人群。標(biāo)本采集及外周血白細(xì)胞DNA的提取所有研究個體均采集外周靜脈血5ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，4℃冰箱保存。

1.2.1 ELISA 法檢測NSCLC 病例組與健康對照組之間靜脈血IL-13Rα2 蛋白表達(dá)差異。

1.2.2 采血后一周內(nèi)以蛋白酶K 消化-飽和氯化鈉鹽析法提取外周血白細(xì)胞DNA。

1.2.3 應(yīng)用針對C和T等位基因的Taqman 探針對基因型鑒定，分析NSCLC 病例組和健康對照組IL13RΑ2 SNP 位點(diǎn)的基因型。IL13RΑ2 rs17095919(C256T) 引物為:Forward primer 5’-ACCTTTGCCGCCAGTCTATCTTAC -3’；Reverse primer 5’ -TGTCGGGTTTCATTTGTTGTTTTC-3’，針對C和T等位基因的Taqman 探針。反應(yīng)體系總體積為25μl，包括模板DNA2μl，10×緩沖 液2.5μl，250 mmol/L MgCl20.3μl，10 mmol/L dNTP 0.7μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，特異性探針0.5μl。余量用蒸餾水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95℃15 min，接著是45個循環(huán)：95℃變性20 s，58℃退火20 s，72 ℃延伸20 s。直接觀察實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)曲線，擴(kuò)增曲線發(fā)生抬高的證實(shí)為存在與Taqman 探針對應(yīng)的等位基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 方法檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)正常人幾乎無IL-13Rα2 蛋白的表達(dá)，NSCLC 病例組IL-13Rα2蛋白水平達(dá)到5.7ng/ml(SD=0.34)，與健康對照組之間相比靜脈血IL-13Rα2 蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。

2.2 NSCLC 患者和健康對照組的IL13RΑ2的等位基因頻率分布見表1，等位基因頻率分別為49.0%、51.0%和48%、52%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無顯著性差異。在兩組人群中，等位基因C和T 頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡法則。NSCLC 患者和健康對照組的IL13RΑ2的基因型分布見表2，可以發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者IL13RΑ2的基因型C/T與健康對照存在顯著差異，因此可以認(rèn)為IL-13RA2的C/T 基因型與NSCLC 易感性相關(guān)，其他基因型在組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與NSCLC 易感性無關(guān)。

表1 等位基因頻率分布

3 討論

我國肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年升高，位居城市人口中惡性腫瘤之首。表皮生長因子受體(EGFR)在多種惡性腫瘤的發(fā)病和加重過程中起了重要作用，在臺灣人群中EGFR 基因的多態(tài)性與不吸煙的女性肺腺癌患者發(fā)病過程高度相關(guān)[2]。國內(nèi)對肺癌診斷的聯(lián)合指標(biāo)進(jìn)行了廣泛的研究，包括TPS、NSE、CEA、LunXmRNA 及血清骨保護(hù)素等指標(biāo)在肺癌診斷中價值[3-5]。韓國的1項(xiàng)研究表明了轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β 基因SNPs與肺癌的發(fā)病和預(yù)后的關(guān)系，A-1572G，C-509T和T+869C 在雜合子基因型攜帶者的重度吸煙者肺癌發(fā)病風(fēng)險高[6]。這些眾多研究表明細(xì)胞因子及其受體基因表達(dá)的多態(tài)性與肺癌的發(fā)病風(fēng)險增加和病程發(fā)展高度相關(guān)。IL-13 主要由激活的輔助T 淋巴細(xì)胞(Th2)細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生，它是一種多功能的細(xì)胞因子，起著調(diào)節(jié)炎癥、黏液產(chǎn)生、組織重建和纖維化的作用。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-13的高親和力受體IL-13Rα2 過度表達(dá)在許多種固體癌細(xì)胞上如小兒腦瘤、惡性膠質(zhì)瘤、卵巢癌、星形細(xì)胞瘤等。這說明IL-13Rα2的表達(dá)與癌癥高度相關(guān)。IL-13的高親和力受體：IL-13 受體α2 在正常組織表達(dá)很低，O'Toole M等人用一種獨(dú)特ELISA 方法研究證實(shí)正常人血漿中無IL-13Rα2表達(dá)[7]，卻在腫瘤上有著高表達(dá)。Daines MO等人研究證實(shí)IL-13Rα2 有三種形式：細(xì)胞膜表面、細(xì)胞內(nèi)和一種可溶形式 (sIL-13Rα2)，IL-13Rα2 蛋白主要存在細(xì)胞內(nèi)，膜表面IL-13Rα2 釋放于介質(zhì)中即表現(xiàn)為sIL-13Rα2，并且胞質(zhì)內(nèi)IL-13Rα2 不斷運(yùn)輸至細(xì)胞表面補(bǔ)充膜表面IL-13Rα2[8]。而sIL-13Rα2的表達(dá)可被炎癥反應(yīng)[9]、寄生蟲感染[10]、變態(tài)反應(yīng)和激惹[11]所誘導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了sIL-13Rα2與NSCLC 有關(guān)。因?yàn)閏SNPs可以進(jìn)行疾病的遺傳連鎖分析及關(guān)聯(lián)分析，用于疾病易感基因定位，本研究進(jìn)一步證實(shí)IL-13RA2 基因cSNPs：rs17095919(IL13RΑ2 第七外顯子第一密碼子256 位置C/T)SNP與NSCLC的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。其中NSCLC組的C/T 雜和基因型頻率明顯高于對照組，其他基因型在各組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IL-13RA2 基因C/T 基因型為NSCLC 易感基因型，IL-13RA2 其他基因型與NSCLC 無關(guān)。遺傳學(xué)家認(rèn)為，對復(fù)雜多基因疾病的研究，要綜合考慮種族、樣本量、實(shí)驗(yàn)手段、統(tǒng)計(jì)方法，甚至不同疾病的生理、病理等多方面因素的考慮，才能得到科學(xué)的、可信的結(jié)論。因此我們通過對IL-13RA2 單核苷酸多態(tài)性與NSCLC的發(fā)生機(jī)制深入研究，確定了IL-13RA2 SNPs的C/T 基因型與NSCLC的強(qiáng)相關(guān)關(guān)系，對NSCLC的診斷和治療將更有針對性，甚至做到個體化。同時建立有效的預(yù)警系統(tǒng)后，達(dá)到有效的一級預(yù)防目的，將大大減少NSCLC 患者的發(fā)病率，從而降低NSCLC 患者的診療費(fèi)用。NSCLC 鱗癌和腺癌IL13RΑ2 單核苷酸多態(tài)性之間的相關(guān)性在本研究中未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，但有待進(jìn)一步研究。

[1]linna JD.Molecular pathogellesis oflung carIoer[J].Cancer，2000，29(2)：37-38.

[2]Jou YS,Lo YL,Hsiao CF,et al.Association of an EGFR intron 1 SNP with never-smoking female lung adenocarcinoma patients [J].Lung Cancer,2009,64(3):251-256.

[3]蔡常輝，杜滿興.TPS 檢測及與CYFRA21-1、NSE、CEA 聯(lián)檢對肺癌的診斷價值[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(2):145-146.

[4]殷金蘭，陳肖燕.血清骨保護(hù)素在肺癌診斷中的臨床價值[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,27(1):7-9.

[5]應(yīng)漂漂,王茂峰,王巧燕,等.LunX mRNA 聯(lián)合CEA、SCCA、CYFRA21-1 三項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物診斷非小細(xì)胞肺癌的臨床應(yīng)用價值[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,27(6):591-594.

[6]Park KH,Lo Han SG,Whang YM,et a1.Single nucleotide palymorphisms of the TGFB1 gene and lung cancer risk in a Korean population[J].Cancer Genet Cytogenet,2006,169(1):39-44.

[7]O'Toole M,Legault H,Ramsey R,et al.A novel and sensitive ELISA reveals that the soluble form of IL-13R-alpha2 is not expressed in plasma of healthy or asthmatic subjects[J].Clin Exp Allergy,2008,38(4):594-601.

[8]Daines MO,Tabata Y,Walker BA,et al.Level of expression of IL-13R alpha 2 impacts receptor distribution and IL-13 signaling[J].Immunol,2006,176(12):7495-501.

[9]David M,Ford D,Bertoglio J,et al.Induction of the IL-13 receptor alpha2-chain by IL-4 and IL-13 in human keratinocytes:involvement of STAT6,ERK and p38 MAPK pathways [J].Oncogene,2001,20(46):6660–6668.

[10]Mentink K,Cheever AW,Thompson RW,et al.IL-13 receptor α2 down-modulates granulomatous inflammation and prolongs host survival in schistosomiasis [J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(2):586–590.

[11]Yasunaga S,Yuyama N,Arima K,et al.The negative-feedback regulation of the IL-13 signal by the IL-13 receptor 2 chain in bronchial epithelial cells[J].Cytokine,2003,24(6):293–303.