王躍生,王雪峰

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院普外一科,黑龍江 佳木斯 154003)

在人的實體腫瘤中,缺氧已經成為一種普遍存在的現象,而缺氧所誘導的新生血管形成已經成為腫瘤惡性程度和是否轉移的重要標志。在正常的組織中,hif-1 α基因雖表達,但是其又很快在組織中被代謝掉,只有在腫瘤細胞中才能夠監(jiān)測到 hif-1 α的存在[1]。那么實體腫瘤中心的乏氧區(qū)所誘導的 hif-1α高表達對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是否會具有重要的生物學意義已經成為了眾多的專家和學者所研究的重點。它的存在是否導致了腫瘤細胞對缺氧的耐受,是否促進了腫瘤細胞向更壞的方向發(fā)展已經被越來越多的人所重視。本研究旨在探討一下 hif是否對腫瘤細胞的細胞周期和凋亡是否有影響以及這些影響是否對于腫瘤靶向治療具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

穩(wěn)定轉染空載體和 hif1a shRNA載體的小鼠黑色素瘤細胞 B16,由吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生部放射生物學重點實驗室保存,標記為 B16-Control和 B16-sihif1-a。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):B16細胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(含100U˙mL-1青霉素和鏈霉素)于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞的照射及固定:取對數生長期細胞培養(yǎng)于6孔板中,每孔細胞5×105于24h后照射,照射劑量分別為0,1,2,4Gy,劑量率0.287Gy/min,照射后24h用胰蛋白酶消化收取細胞,75%的冷乙醇固定,-20℃保存待用。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡變化:采用 PI標記 ,流式細胞術(FCM)檢測細胞周期的變化。細胞用 PBS洗2次,RN Ase消化30min后加入5% PI 200μL,4℃避光孵育30min流式細胞儀檢測,CELLQ uest軟件收取細胞(每份樣品收取1×104個細胞),ModF it軟件分析細胞周期,結果以細胞周期各時相細胞的百分率表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 t檢驗。

2 結果

2.1 穩(wěn)定轉染 hif1-a shRNA載體對 B16細胞周期的影響

不同劑量照射后 ,對照組和 sihif-a組 G2+M細胞隨著劑量的增加均出現了明顯增加 (P＜0.01),相同劑量下,sihif-a組 G2+ M細胞明顯低于對照組 (P ＜0.05,P＜0.01),而 G0/G1細胞出現降低,與此同時 S細胞也有一定程度的降低(見表1)。

2.2 穩(wěn)定轉染 hif-1 αshRN A載體對 B16細胞凋亡的影響

照射后,對照組和 sihif1-a組細胞的凋亡率隨著輻射劑量的增加而增大,相同劑量下,sihif1-a組與對照組比,細胞凋亡率有增高趨勢,見表2。

表1 不同的輻射劑量對 B16細胞周期的影響 ±s)

表1 不同的輻射劑量對 B16細胞周期的影響 ±s)

*P＜0.05,**P＜0.01與同組的最小劑量比較;#P＜0.05,##P＜0.01兩組間相同輻射劑量的比較。

表2 不同的輻射劑量對 B16細胞凋亡的影響 ±s)

表2 不同的輻射劑量對 B16細胞凋亡的影響 ±s)

*P＜0.05,**P＜0.01與同組的最小劑量比較。#P＜0.05,##P＜0.01兩組間相同輻射劑量的比較。

3 討論

在腫瘤的惡性化進程中,腫瘤惡性程度發(fā)展的關鍵是細胞對氧濃度的適應和腫瘤細胞血管生成起決定性作用。氧環(huán)境是腫瘤細胞生長、凋亡、轉移等的主要動力,而 hif-1α起關鍵作用,在促進腫瘤周邊血管及自身血管的生成和腫瘤的侵襲性方面起中心作用[2]。經輻射誘導的細胞 DN A損傷,當損傷程度過大超過細胞自身系統(tǒng)的修復能力,那么細胞就啟動了凋亡程序,導致細胞的程序性死亡[3],而損傷的程度在可以修復的范圍內,那么細胞自身就會通過一系列的通路引起細胞的周期阻滯,使細胞停留在細胞周期的各個階段,抑制 DNA復制,阻止細胞分裂,為 DN A修復系統(tǒng)修復損傷提供充足的時間以減少損傷所致的細胞死亡以及避免突變損傷進入子代細胞[4]。所以在腫瘤的輻射治療過程中應當最大限度地降低細胞阻滯而使腫瘤細胞盡可能多地進入調往過程中去,這樣才能夠提高放射治療腫瘤的療效。實驗研究證明[5]在實體腫瘤中存在著廣泛的乏氧區(qū),而這些乏氧區(qū)的存在對腫瘤治療效果的研究一直被研究者所關注,這些部位在腫瘤的治療過程中是否起到一定的作用也一直是研究者所研究的重點。本實驗采用 RN Ai方法以觀察 hif-1α表達的對輻射誘導的腫瘤細胞的周期阻滯和凋亡的影響,實驗中通過兩組實驗的對比我們發(fā)現轉染 hif-1αshRNA組細胞的凋亡率有了一定程度的提高,而且在細胞周期阻滯方面也可以看到 G2+M期阻滯的降低。分析其可能的機制是輻射直接或間接地損傷腫瘤細胞 DN A,由于 hif-1α表達下降 ,受損傷的細胞不能堆積于 G2期進行修復而直接發(fā)生凋亡。對多數細胞來說,M期和 G2期的細胞相對其他細胞而言對輻射的敏感性極強,而 G1期次之,S期的細胞對輻射極弱甚至無敏感度。關于處于不同時期的細胞周期對細胞輻射抗性差異的機理作用,還不清楚。真核細胞受照射后,可以誘導并阻滯 G2期的出現,這對保證細胞的完整性、損傷后細胞的存活和保持細胞的遺傳穩(wěn)定性方面具有重要生物學和遺傳學意義。細胞處于 G2期阻滯狀態(tài),使許多損傷細胞的 DNA及時得到修復,這樣極有利于細胞的存活[6]。另外,細胞 G2期阻滯與細胞輻射敏感強度有關。預先用咖啡因對哺乳動物細胞照射后,可以使細胞存活率明顯下降。就本實驗而言,轉染hif1-a shRN A對輻射誘導的 B16細胞的影響是降低了了細胞周期 G2期的百分率,從腫瘤的治療的角度來講這是一個非常好的現象。但是阻滯的發(fā)生是否會引起腫瘤細胞的休眠,而給腫瘤的治療帶來不良的后果我們還不得而知,還是需要進一步的研究。

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