王景霞,鄧文偉,劉曉梅,齊亞靈,王淑英,李 堯,張 輝,李 文

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

腦缺血再灌注損傷的病理機制十分復(fù)雜,隨著醫(yī)學(xué)的不斷進步,目前眾多學(xué)者認為,腦缺血再灌注損傷與神經(jīng)凋亡細胞的關(guān)系密切。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡,它并不是病理條件下自體損傷的一種現(xiàn)象,而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用。隨著對細胞凋亡的不斷認識及生物學(xué)的迅速發(fā)展,認為無論急性局灶性腦缺血、缺血再灌注,還是短暫性腦缺血都有神經(jīng)元凋亡的參與[1]。凋亡在缺血性損害中尤其是再灌注損傷中起著重要作用。黃芪具有補氣生陽、益氣固表、抗毒生肌之功能,具有明顯的抗氧化和清除自由基的作用。本實驗應(yīng)用大鼠腦缺血再灌注損傷模型觀察黃芪對缺血側(cè)皮層神經(jīng)元凋亡及 c-fos/c-jun表達的影響,探討缺血再灌注損傷過程中細胞凋亡的發(fā)生機制,和黃芪對腦缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

雄性 Wistar大鼠30只,體重280～ 320g,由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供,隨機分為①假手術(shù)組②缺血再灌注組③黃芪組每組10只,假手術(shù)組僅分離血管;黃芪組造模前 3天開始黃芪注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn))4.5/kg腹腔注射每日1次,共 4次。①②組造模前 3天腹腔注射給予等劑量生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 參照文獻[2]:方法采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型。結(jié)扎大鼠頸總動脈和頸外動脈,自頸總動脈分叉處向頸內(nèi)動脈插入線栓約(18.5±0.5)mm,阻斷大腦中動脈血流,造成局灶性腦缺血。術(shù)后將栓線尾部置于皮下,缺血2h后輕拔栓線造成血流再灌注。

1.2.2 取材:大鼠再灌注24h后用10%水合氯醛過量麻醉,迅速開胸暴露心臟,經(jīng)升主動脈插管后灌注生理鹽水快速沖洗,再用4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)至肝臟退色變硬、四肢、尾變硬。斷頭取腦,取視交叉前后約 2～ 3mm范圍的冠狀切片腦組織置于4%多聚甲醛中4℃條件下固定24～ 48h,常規(guī)石蠟包埋。

1.2.3 c-fos、c-jun免疫組化染色;c-fos、c-jun多克隆抗體和 SABC免疫組化試劑盒由武漢博士德生物公司提供,嚴格按照說明書進行具體操作。

1.2.4 原位細胞凋亡檢測:采用 TUN EL法原位標記 DN A片段檢測凋亡細胞,試劑盒由武漢博士德生物公司提供,嚴格按照說明書進行具體操作。

1.2.5 陽性細胞的檢出:TUN EL細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,即凋亡細胞。c-fos陽性細胞細胞核呈棕色,c-jun陽性物質(zhì)位于細胞質(zhì)內(nèi),在缺血側(cè)大腦皮層切片中隨機采集5個高倍鏡視野 (400×),取平均值,為該切片凋亡細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原位細胞凋亡檢測結(jié)果

神經(jīng)元細胞胞體縮小,核膜皺縮,染色不均,濃聚核膜附近,胞核呈棕黃色,可見核固縮和核碎裂。①假手術(shù)組未見細胞凋亡 ②缺血再灌注組凋亡神經(jīng)細胞數(shù)較假手術(shù)組顯著增多 (P＜0.05)。與缺血再灌注組相比,③黃芪組大鼠缺血側(cè)腦組織凋亡神經(jīng)細胞數(shù)目顯著較少 (P＜0.05)。

2.2 c-fos染色結(jié)果陽性神經(jīng)元的細胞核被染成棕色,陰性細胞胞核不著色。陽性細胞主要分布于皮質(zhì),假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū) c-fos陽性細胞較少,缺血再灌注組皮質(zhì)區(qū)與假手術(shù)組比較 c-fos陽性細胞數(shù)量明顯增高,黃芪組與假手術(shù)組比較皮質(zhì)區(qū) c-fos陽性細胞數(shù)量增多,與缺血再灌注組比較明顯下降。

2.3 c-jun染色結(jié)果陽性神經(jīng)元的細胞質(zhì)被染成棕色,陰性細胞胞質(zhì)不著色。陽性細胞主要分布于皮質(zhì),假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū) c-jun陽性細胞較少,缺血再灌注組皮質(zhì)區(qū)與假手術(shù)組比較 c-jun陽性細胞數(shù)量明顯增高,黃芪組與假手術(shù)組比較皮質(zhì)區(qū) c-jun陽性細胞數(shù)量增多,與缺血再灌注組比較明顯下降。

2.4 各組腦組織 HE染色結(jié)果:假手術(shù)組、腦組織細胞結(jié)構(gòu)完整,未見明顯細胞水腫壞死現(xiàn)象,神經(jīng)元數(shù)量多,形態(tài)正常。模型組可見明顯的組織水腫,缺血邊緣區(qū)神經(jīng)元稀疏,可加大量變性壞死的神經(jīng)細胞,胞體皺縮,核固縮深染,核仁消失。黃芪組水腫減輕,損傷范圍變小。

表1 缺血再灌注組和黃芪組細胞凋亡、c-jun及 c-fos表達的比較 ±s,n=10)

表1 缺血再灌注組和黃芪組細胞凋亡、c-jun及 c-fos表達的比較 ±s,n=10)

黃芪組與缺血再灌注組相比 P＜0.05,*P＜0.05。

3 討論

細胞凋亡是腦缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡的主要形式[3],細胞凋亡是在一定條件下通過激活和啟動細胞內(nèi)某些特定基因,并在此基因調(diào)控下發(fā)生的細胞主動死亡過程,又叫程序性死亡。凋亡的細胞其細胞膜仍保持完整 ,或可因細胞膜皺縮使胞膜形成小泡存于胞體中(凋亡小體),其細胞器及細胞內(nèi)容未被溶解,凋亡細胞周圍無炎性反應(yīng)。凋亡細胞的核內(nèi) DNA分子由依賴性核酸內(nèi)切酶把 DN A裂解成(180～ 200)bp的寡核苷酸片段。細胞凋亡是一種可逆的細胞死亡形式,因此,在臨床上對腦缺血損傷的治療主要是救治凋亡神經(jīng)元。本實驗結(jié)果顯示大腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量增多,與其他學(xué)者報道一致,表明細胞凋亡是缺血再灌注損傷細胞死亡機制之一。

原癌基因及其蛋白產(chǎn)物參與細胞的正常生長發(fā)育分化過程,還有作為核內(nèi)信使參與細胞內(nèi)的信息傳遞。在原癌基因家族中,c-fos、c-jun基因是被最早定義的即刻早基因之一,藕聯(lián)細胞外信息與細胞內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄。c-fos、c-jun基因能被創(chuàng)傷刺激、缺血抽搐和感覺刺激等誘導(dǎo)表達。c-fos和 c-jun都是促凋亡基因,其表達產(chǎn)物 FOS和 JUN是核內(nèi)DN A結(jié)合蛋白,兩者通過亮氨酸拉鏈(leicine zipper)相連形成異源二聚體 AP-1復(fù)合體。AP-1的 DNA結(jié)合區(qū)域有TPA反應(yīng)元件,可通過各自的堿性氨基酸區(qū)域與 DNA結(jié)合,調(diào)節(jié) DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)其他多種含 TPA反應(yīng)元件的基因表達,并作為基因調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)靶基因或晚發(fā)基因的轉(zhuǎn)錄 ,進而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[4]。在正常生理條件下,腦中只能檢測到極低水平 c-fosmRN A。AP-1有很多功能 ,比如神經(jīng)保護作用、學(xué)習(xí)功能、另一些則顯示了 c-fos和 c-jun的神經(jīng)毒性作用[5,6]。c-jun基因促進細胞的增殖、分化及誘導(dǎo)細胞凋亡,c-jun誘導(dǎo)細胞凋亡的機制目前推測為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]。有研究表明細胞凋亡控制基因在腦缺血損害中參與凋亡的發(fā)生,升高的 c-fos、c-jun參與神經(jīng)細胞的凋亡,提示腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡受基因調(diào)控[8]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃芪具有抗自由基、減少腦缺血后腦組織水腫、保護血腦屏障,對抗炎性介質(zhì)等作用,對缺血后腦組織具有多種保護作用,可緩解、缺血導(dǎo)致的 EAA釋放增多和細胞 Ca2+增多,緩解缺血、缺氧所致的代謝紊亂,從而減輕了缺血導(dǎo)致的腦損害、使缺血誘導(dǎo)的 c-fos、c-jun蛋白高表達顯著下調(diào)[9,10]。閔小芬等[11]研究顯示,黃芪對大鼠線栓法局灶性腦缺血-再灌注后引起的腦組織及其線粒體中超氧化物歧化酶活性的降低有明顯的抑制作用,能減少大鼠腦組織乳酸含量的增加,改變腦組織神經(jīng)元在腦缺血-再灌注后的結(jié)構(gòu)破壞。本實驗表明黃芪具有抑制 c-fos、c-jun蛋白表達,細胞凋亡數(shù)量明顯減少,說明黃芪對腦缺血再灌注損傷有保護作用。保護機制與抑制 c-fos、c-jun蛋白表達,減少細胞凋亡有關(guān)。

[1] 王新志,韓群英,郭學(xué)芳.中風(fēng)腦病診療全書 [M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2000,20-30

[2] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke,1989,20:84-91

[3] Beilharz EJ,Williams CE,Dragunow M,et al.Mechanisms of delayed cell death following hypoxic-ischermia injury in the immature rat:evidence for apoptosis during selective neuronsalloss[J].Mol Br Res,1995,29(1):1-14

[4] 周珂,李庚山,余紹祖.腦缺血再灌注損傷時 c-fos、c-jun的表達和細胞凋亡 [J].卒中與神經(jīng)疾病,2003,10:3-6

[5] Kuroda KO,Ornthanalai V G,Kato T,et al.Fos B null mutant mice show enhanced methamphetamine neurotoxicity: potential involvement of Fos B in intracellular feedback signaling and astroglial function[J].Neuropsy-chopharmacology,2010,35(3):641

[6] Deng X,Jayanthi S,Ladenheim B,et al.Mice with partial deficiency of c- jun show attenuation of methamphetamineinduced neuronal apoptosis[J].Mol Pharmacol,2002,62(5):993

[7] 朱鐵梁,張莉,汪超,等.絞股藍總皂苷對 c-jun在大鼠全腦缺血再灌注損傷后的齒狀回和頂葉皮質(zhì)的蛋白表達影響[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,16,(5):501-505

[8] Gillardon F,Lenez C,Waschke K F,et al.Altered expression of bcl-2,Bcl-x,bax and c-fox colocalizes with DNA fragenttation and is chemic cell damage following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Mol Brain Res,1996,40:254

[9] 張艷娟,王景霞,原德新,等.黃芪注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2010,33(6):54-55

[10] 王淑賢,原德新.黃芪注射液預(yù)處理對大鼠缺血再灌注后神經(jīng)功能評分的影響 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2011,34(6):107

[11] 閔小芬,李衛(wèi)平,王紹斌,等.黃芪提取物對局灶性腦缺血再灌注損傷的抗氧化及線粒體保護作用 [J].中國藥理學(xué)通報,2005,21(2):216-219