林秀英,韓振東,尹淑紅,崔 堯

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院皮膚科,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

皮膚癌是人類最常見的惡性腫瘤,尤其是發(fā)生于暴露部位的鱗狀細(xì)胞癌,發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重影響人類的身體健康。目前皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療手段主要是外科切除,人體最暴露部位的手術(shù)瘢痕會(huì)影響患者的美觀需求以及生活質(zhì)量。近年來(lái)腫瘤的化學(xué)治療逐漸引起人們的重視,尤其是聯(lián)合用藥?？商岣忒熜?。第一代維甲酸13-順維甲酸與干擾素α-2a(IFN α-2a)最早被應(yīng)用于皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者。第二代維甲酸依曲替酯和干擾素α聯(lián)合治療鱗狀細(xì)胞癌患者取得較好效果[1]。本研究探討第二代維甲酸阿維 A酸聯(lián)合干擾素 α-2a對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞 SCL-1的生長(zhǎng)抑制、凋亡誘導(dǎo)作用,為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

阿維 A酸購(gòu)自重慶華邦藥業(yè)公司。干擾素α-2a(IFNα-2a)購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所。細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hyclone公司。二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(M TT)為美 國(guó) Sigma公 司產(chǎn) 品。Cell Death Detection ELISAPLUS試劑盒購(gòu)于德國(guó) Roche公司。Annexin-VFITC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳晶美公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SCL-1細(xì)胞系生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理及分組

阿維 A酸用 DMSO,IFN α用生理鹽水配制成儲(chǔ)存液-20°C保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要用培養(yǎng)液稀釋。實(shí)驗(yàn)設(shè)溶媒對(duì)照組、不同濃度的單藥作用組和聯(lián)合用藥組,其中 IFN α按濃度不同分為100U/mL,500U/mL,1000 U/mL 3個(gè)亞組;阿維A酸分為0.1umol/L,1umol/L,10umol/L 3個(gè)亞組 ,聯(lián)合用藥組按單藥不同濃度進(jìn)行組合。

1.2.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

將 SCL-1細(xì)胞接種在96孔板上,于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期按分組要求加入相應(yīng)的處理因素 ,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔 ,培養(yǎng) 72 h后 ,加入 MTT20 μL,37℃孵 育 4h,棄上 清 液,每 孔 加 入 100μL DMSO,震蕩10min,酶標(biāo)儀490nm測(cè)吸收光度(A)。細(xì)胞存活率=(加藥組 A值 /對(duì)照組 A值)×100%。

1.2.4 Cell Death Detection ELISA檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將 SCL-1細(xì)胞接種在 96孔板上,根據(jù) M TT實(shí)驗(yàn)結(jié)果分組如下:溶媒對(duì)照組,IFNα組 (100U/mL),阿維 A酸組(I umol/L)及二者合用組 (IFNα 100U/mL+阿維 A酸 I umol/L)。于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期向細(xì)胞中分別加入各組藥物,培養(yǎng)72 h后按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)凋亡。

1.2.5 Annxin-V和 PI結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)早期凋亡

分別用 1umol/L阿維 A酸,100U/mL IFNα,及阿維 A酸聯(lián)合 IFNα作用于 SCL-1細(xì)胞72h后收集細(xì)胞 ,Annxin-V和 PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

相應(yīng)數(shù)據(jù)用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行方差分析,以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的阿維 A酸及 IFNα單用或聯(lián)用72h對(duì) SCL-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

三種用藥形式均可抑制 SCL-1細(xì)胞的生長(zhǎng),與溶媒對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。除100U/mL、500U/mL的 IFNα與0.1umol/L的阿維 A酸聯(lián)合外,其余各聯(lián)合用藥組與單用相比抑制作用明顯增強(qiáng),且抑制作用隨濃度的增加而遞增。見表1。

表1 阿維 A酸 /干擾素 α對(duì) SCL-1細(xì)胞的抑制率(%,±s)

表1 阿維 A酸 /干擾素 α對(duì) SCL-1細(xì)胞的抑制率(%,±s)

*P ＜0.05與對(duì)照組比較;△P＜0.05與單獨(dú)應(yīng)用阿維 A酸或干擾素比較。

2.2 阿維 A酸及 IFNα單用或聯(lián)用對(duì) SCL-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

方差分析 Cell Death Detection ELISA檢測(cè)結(jié)果,各組凋亡吸光度總體均數(shù)不等(F=80.35,P＜0.01)。進(jìn)一步兩兩比較,100U/mL的 IFN-α,lumol/L的阿維 A酸及二者聯(lián)合應(yīng)用均能誘導(dǎo) SCL-1細(xì)胞凋亡,與溶媒對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。聯(lián)合用藥組對(duì) SCL-1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用顯著高于單用應(yīng)用 IFNα或阿維 A酸組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜ 0.05)。見圖1。

圖1 阿維 A酸、干擾素α作用 SCL-1細(xì)胞72h后的凋亡誘導(dǎo)情況

2.3 AnnexinV和 PI雙標(biāo)記法檢測(cè)凋亡率

方差分析 Annxin-V和 PI結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,各組早期凋亡率總體均數(shù)不等 (F= 66.03,P＜0.01)。進(jìn)一步兩兩比較,100 U/mL的 IFNα,l umol/L的阿維 A酸及二者聯(lián)合應(yīng)用均能誘導(dǎo) SCL-1細(xì)胞早期凋亡,與溶媒對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。聯(lián)合用藥組對(duì) SCL-1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用顯著高于單用應(yīng)用 IFN α或阿維 A酸組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜ 0.05)。見圖2、圖3。

圖2 Annexin v和 PI雙標(biāo)記法檢測(cè)阿維 A酸、干擾素α誘導(dǎo) SCL-1細(xì)胞凋亡

圖3 阿維 A酸、干擾素α作用 SCL-1細(xì)胞72h后的早期凋亡率

3 討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方法,除常規(guī)的化療、放療與激素治療,細(xì)胞因子的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。體外實(shí)驗(yàn)證明,采用聯(lián)合用藥的誘導(dǎo)凋亡療法,對(duì)腫瘤的治療可能是最有效可行的。因此,尋求有效的誘導(dǎo)腫瘤凋亡療法,成為目前腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。維甲酸類化合物已證實(shí)對(duì)人類多種惡性腫瘤具有誘導(dǎo)分化、抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡等作用[2]。由于存在對(duì)維甲酸的耐受、敏感性低的腫瘤類型,以及維甲酸所帶來(lái)的副作用,限制了它的臨床應(yīng)用。為了解決這一問(wèn)題,人們探索維甲酸與其它藥物聯(lián)合使用以提高腫瘤對(duì)維甲酸治療的敏感性,已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。已有研究證實(shí)阿維 A酸能夠抑制皮膚鱗癌細(xì)胞 SCL-1生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡[3]。干擾素是細(xì)胞因子中的一個(gè)家族,具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[4]。IFNα能誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡[5,6],并抑制其增生。本研究應(yīng)用細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度阿維A酸、IFNα單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì) SCL-1細(xì)胞的增殖抑制情況。該方法簡(jiǎn)便、快速,所需細(xì)胞數(shù)較少,便于進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn),目前已廣泛用于臨床前抗癌藥物篩選研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),阿維 A酸、IFNα單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用72h均可抑制 SCL-1細(xì)胞增殖。聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥比較均具有顯著的差異,并且在一定范圍內(nèi)有劑量依賴性,說(shuō)明聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗癌作用。根據(jù)我們的 M TT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇阿維 A酸1uM聯(lián)合IFN100U/mL組 ,阿維 A酸1uM組,IFN1000U/mL組及溶媒對(duì)照組作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)分組。Cell Death Detection ELISA及Annxin-V和 PI結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,聯(lián)合應(yīng)用阿維 A酸與 IFN對(duì) SCL-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用明顯高于單獨(dú)應(yīng)用阿維 A酸或 IFN,說(shuō)明二者可協(xié)同誘導(dǎo)皮膚鱗癌細(xì)胞凋亡。綜上所述,本研究證實(shí)維 A酸與 IFNα聯(lián)合應(yīng)用,可增效減毒,抑制 SCL-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。阿維 A酸 /IFNα聯(lián)合應(yīng)用為皮膚鱗癌的化療提供可選藥物組合,從分子角度深化了阿維 A酸與 IFN協(xié)同抗腫瘤的作用機(jī)制。從而為皮膚鱗癌的治療提供了新的思路。

[1] Pepper C,Ali K,Thoma A,et al.Retinoid-induced apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukaemia cells is mediated through caspase-3 activation and is independent of p53,the retinoic acid receptor,and differentiation[J].Eur JH aematol,2002,69:227-235

[2] Chung KD,Jeong YI,Chung CW,et al.Anti-tumor activity of all- trans retinoic acid-incorporated glycol chitosan nanoparticles against HuCC- T1 human cholangiocarcinoma cells[J].IntJ Pharm,2012,422(1-2):454-461

[3] Lin XY,He CD,Xiao T,et al.Acitretin induces apoptosis through CD95 signalling pathway in human cutaneous squamous cell carcinoma cell line SCL-1[J].J Cell Mol Med,2009,1(9a):2888-2898

[4] Park YK,Shin DJ,Cho D,et al.Interleukin-21 increases direct cytotoxicity and IFN-γ production of ex vivo expanded NK cells towards breast cancer cells[J].Anticancer Res,2012,32(3):839-846

[5] Simoni D,Tolomeo M.Retinoids,Apoptosis and Cancer Current[J].Pharmaceutical Design,2001,7:1823-1837

[6] Simon,Korber C,Krausch M,et al.Clinical impact of rtinoids in redifferentiation therapy of advanced thy roid cancerfinal results of a pilot study[J].Eur J Nucl Med Imaging,2002,29:775-782