王海燕,劉潔薇,胡云秋,孫健飛,鄒艷紅

(1.佳木斯大學臨床醫(yī)學院,黑龍江佳木斯 154003;2.佳木斯大學第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)一科,黑龍江佳木斯 154003)

癲癇(epilepsy)是腦部的一種慢性疾患,其特點是大腦神經(jīng)元反復(fù)發(fā)作性異常放電引起相應(yīng)的突發(fā)性和一過性腦功能障礙。據(jù)國內(nèi)多次大樣本調(diào)查,我國癲癇的年發(fā)病率約為35/10萬人口,它嚴重影響患者的健康,癲癇患者如能用生化指標早期、準確的檢測到腦損傷標志蛋白的變化,及早的給予藥物干預(yù),有效的保護腦神經(jīng)細胞可減少癲癇患者的腦損傷,提高癲癇患者的生活質(zhì)量。S100β蛋白是一種腦內(nèi)特異性蛋白主要由膠質(zhì)細胞分泌,對癲癇所致的腦損傷有高度特異性。有人認為低濃度 S100β[1]對神經(jīng)有營養(yǎng)及保護作用,高濃度 S100β具有神經(jīng)毒性作用。IL-10最初發(fā)現(xiàn)是在鼠體內(nèi),它由鼠 Th2細胞分泌,IL-10又稱為細胞因子合成抑制因子,是一種重要的抗炎因子,它可以通過抑制多種炎癥細胞的粘附而達到抗炎作用 ,同時 IL-10還可以促進炎癥部位中性粒細胞的凋亡,進而達到免疫調(diào)節(jié)的作用。何大可[2]等研究發(fā)現(xiàn)癲癇患者外周血中 IL-10水平明顯高于正常對照組。本課題擬建立海人酸致癇大鼠模型,檢測大鼠外周血中S100 β及 IL-10的表達,以及左乙拉西坦對其表達的影響。以尋求抗癲癇新藥左乙拉西坦腦保護機制的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級 28d齡雄性 Wistar大鼠96只 ,體重 90～ 100g,由大連醫(yī)科大學提供、IL-10ELISA試劑盒、S100β ELISA試劑盒、左乙拉西坦、海人酸、大鼠灌胃針、大鼠腦立體定位儀、微量進樣器、離心機、恒溫水浴箱、酶標儀、洗板機、加樣槍。

1.2 模型的建立及標本的采集

將實驗動物隨機分為3組,生理鹽水對照組32只、KA組32只、LEV組32只,并用5%苦味酸溶液編號。10%水合氯醛(360mg/kg)腹腔注射麻醉 Wistar大鼠,麻醉滿意后 (約5min)取大鼠俯臥位將頭部固定于立體定位儀上,剪去頭部鼠毛,局部消毒,取大鼠頭部正中線做縱行切口,長10mm左右,鈍性剝離顱骨上腱膜及顱骨外膜,確定前囟。參照大鼠腦立體定位圖譜,確定海馬 CA3區(qū)三維坐標既 x軸3mm,y軸3mm,z軸4mm,將前囟作為原點,分別向下3mm及中線右旁開3mm處,用牙鉆鉆一直徑約為1mm的圓孔。用微量進樣器抽取 KA1μL(濃度大0.4μ g/μL)并將微量進樣器固定在 z軸上沿鉆孔進針,深度達 4mm,緩慢勻速注射 KA,在 10min左右注射完畢,保留5min后緩慢退針,縫合頭皮,局部消毒 ,放回籠中飼養(yǎng)。LEV組在 KA注射前12h給予左乙拉西坦灌胃每日二次,并分別于6h、12h、24h、72h四個時間點,將 KA組及 LEV組于右心室采血,每只取2mL血液,置于離心機中(2000轉(zhuǎn) /分 )離心 5min,取 血清備用。

1.3 S100β及 IL-10測定

采用 ELISA法測定大鼠血清中 S100 β及 IL-10水平,操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學資料應(yīng)用 SPSS17.0軟件處理,各組資料以均數(shù)±標準差± s)表示 ,比較采用 t檢驗,P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 用 ELISA法檢測癲癇大鼠血清中 S100β含量

KA組與 LEV組血清 S100β含量與對照組比較,6h無明顯變化 (P＞ 0.05),12h開始升高 (P＜0.05),24h達高峰 (P＜0.01),72h接近正常 (P＞ 0.05)。LEV組與 KA組比較血清 S100β含量在各時間點無顯著差異 (P＞ 0.05)。

表1 大鼠血清 S100β測定結(jié)果 ±s,pg/mL)

表1 大鼠血清 S100β測定結(jié)果 ±s,pg/mL)

注:與對照組比較,*P ＜0.05,5P＜0.01,△ P＞ 0.05。與 KA組比較,#P＞ 0.05。

2.2 用 ELISA法檢測癲癇大鼠血清中 IL-10含量

KA組與 LEV組血清 IL-10含量比較,6h開始升高(P＞ 0.05),12h達高 峰 (P ＜ 0.01),24h開始 下降(P ＜0.05),72h接近正常 (P＞ 0.05)。LEV組與 KA組比較血清 IL-10含量在各時間點無顯著差異 (P＞ 0.05)。

表2 大鼠血清 IL-10測定結(jié)果 ±s,pg/mL)

注:與對照組比較,*P ＜ 0.05,5P＜0.01,△ P＞ 0.05。與 KA組比較 ,#P＞ 0.05。

3 討論

癲癇有著復(fù)雜的發(fā)病機制,雖然學者們分別從離子,電生理,免疫等多方面對癲癇的病因進行研究,但到目前為止有關(guān)癲癇發(fā)生的機制尚未完全闡明,因此,明確癲癇的發(fā)病機制,研制出更有效,副作用少的抗癲癇新藥成為人們的目標。 S100β蛋白是 Moore BW1965年在牛腦中首先發(fā)現(xiàn)的,S100 β蛋白主要是由神經(jīng)膠質(zhì)細胞特別是星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞合成和分泌的,功能主要包括調(diào)節(jié)細胞生長,能量代謝和參與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)[3],故 S100β作為腦損傷的特異性生化標志在指導(dǎo)臨床治療和評估預(yù)后等方面起著重要的作用[4,5]有研究表明 S100β水平與癲癇存在著密切的聯(lián)系,Dyck,H等[6]在研究杏仁核點燃的癲癇模型與 S100β的關(guān)系時發(fā)現(xiàn),S100 β基因敲除型鼠與野生型鼠在行為上更早、更嚴重的出現(xiàn)癲癇,說明基因敲除型鼠在發(fā)生癲癇的難易程度上要高于野生型鼠,由此可以說明生理水平的 S100β具有抗癲癇的作用。IL-10主要由 Th2細胞產(chǎn)生,并通過抑制作用使 T細胞產(chǎn)生的細胞因子減少,進而達到抑制細胞免疫應(yīng)答的作用,大量研究證實癲癇患者外周血中 IL-10水平顯著增高。IL-10可以通過抑制細胞因子及自由基,使 r-氨基丁酸含量增高等方式使大腦皮層神經(jīng)興奮性氨基酸受體得以抑制,同時還可以抑制 Ca2+內(nèi)流,從而達到抗癲癇作用。左乙拉西坦為吡拉西坦衍生物中的左旋乙基吡拉西坦,左乙拉西坦具有口服吸收好、生物利用率高、血藥濃度達峰時間短等優(yōu)點,有學者研究發(fā)現(xiàn),左乙拉西坦治療的30例癲癇患者的認知功能無明顯改變,左乙拉西坦在一定程度上具有腦保護作用。本實驗研究得出,KA致癇大鼠血清 S100β的含量明顯增高?？紤]其增高可能與癲癇所致的腦損傷有關(guān)。KA致癇大鼠血清 IL-10的含量明顯增高。提示其可能參與癲癇的病理生理過程,其可能通過抑制細胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗癲癇作用。LEV對 KA致癇大鼠血清 S100β及 IL-10無明顯影響,提示 LEV短時間干預(yù)不能減輕腦損傷亦不會加重腦損傷。

[1] Barger SW,Van Eldik LJ.S100 istimulates Calcium fluxes in glial and Neuronal Cell[J].J Bio Chem,1992,542:280

[2] 何大可,胡鴻文.癲癇患兒 PBMC分泌 IL-10、IFN-γ的研究[J].溫州醫(yī)學院學報,1999,29,(4):270-271

[3] 張進,丁美萍,劉照,等.持續(xù)癲癇樣放電導(dǎo)致海馬神經(jīng)元鈣離子動力學變化的研究[J].中國應(yīng)用生理學雜志,2007,23(2):200-202

[4] Petzold A,Michel P,Stock M,et al.Glia and axonal body fluid biomar-Kera are related to infarct volume,severity,and outcome[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2008,17(4):196-203

[5] Delgado P,Alvarez Sabin J,Santamarina E.Plasma S100B level after acute spontaneous intracer-ebral hemorrhage[J].Stroke,2006,37(1):2837-2839

[6] Dyck H,Bogoch I,Marks A,et al.Enhanced epilepto-genesis in S100B knockout mice[J].Molecular Brain Research,2002,106(7):22-29