林明華,孟慶媛,郭夢(mèng)凡

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,黑龍江 佳木斯 154007)

燈盞花素[1～4](Breviscapine.Bre)系從云貴高原燈盞花全株植物中提取黃酮類(lèi)有效成分,主要成分是燈盞乙素,具有廣泛的生理活性。肝星狀細(xì)胞[5～7](hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的重要事件及中心環(huán)節(jié)。核因子 -κB(nuclear factor-κB,N F-κB)可在活化的 HSC中活性增強(qiáng),且可提高活化 HSC的存活率[8,9],而 Caspase-3是Caspase家族中最重要的成員,有大量研究證明,大多數(shù)觸發(fā)肝細(xì)胞凋亡最終均需要通過(guò) Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[10,11]。本文主要研究燈盞花素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞 Caspase-3、N F-κ B p65表達(dá)的干預(yù)作用。探討燈盞花素抗肝纖維化作用的可能機(jī)制,為擴(kuò)大燈盞花素在臨床的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持,使其更廣泛地造福于肝纖維化患者。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

純系 Wistar大鼠 60只,雌雄各 半,3月齡,體重 250～300g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

Bre片 (廣東彼迪藥業(yè)有限公司);CCl4(廣州化學(xué)試劑三廠);Caspase-3免疫組化試劑盒、N F-κ B p65免疫組化試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);RT-PCR試劑盒 (上海江萊生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

60只 Wistar大鼠用隨機(jī)數(shù)字表分為 6組:正常對(duì)照組(NOR)、 Bre高劑量組 (DG)、 Bre中劑量組 (DZ)、 Bre低劑量組 (DD)、模型組 (MOD)、秋水 仙堿組 (COLC)。每組 10只 ,正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水,飲用清水,其他各組采取 CCl4腹腔注射法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,飲用乙醇作為唯一水源。第8周末造模成功后,燈盞花素干預(yù)組給予燈盞花素灌胃:濃度 5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg;秋水仙堿組 0.lmg/kg劑量灌胃,同時(shí)正常對(duì)照組與模型組用等量生理鹽水灌胃。于第12周末處死各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,取材。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate aminotransferase,AST)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織 N F-ΚB p65、Caspase-3,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)肝組織 N F-κB p65、Caspase-3 mRN A:

用 β-actin作為內(nèi)參。Caspase-3上下游引物分別為 S:5’ - TGCGCCATGCTGAAACTG - 3’;5’ -TGGCCACCTTCCGGTTAAC-3’,NF- κ B上下游引物分別 為 5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’;3 TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5’,按 PCR試劑盒說(shuō)明操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)氨酶結(jié)果

通過(guò)表1可見(jiàn) MOD大鼠血清 ALT、AST明顯高于 NOR組。與 MOD相比較,DG組、DZ組 ALT、AST均明顯降低(P＜0.05),DD組 ALT(P＜0.05),而 AST無(wú)明顯差異。見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)氨酶結(jié)果(±s;n=10)

表1 轉(zhuǎn)氨酶結(jié)果(±s;n=10)

注:**與 M OD組相比,P＜0.01* 與 MOD組相比,P＜0.05。

2.2 NF- κ B、Caspase-3免疫組化

實(shí)驗(yàn)表明與 NOR組比較 ,MOD組 N F-κ B免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高 (P＜0.01)。COLC組、DG組和 DZ組N F-κB p65顯色指數(shù)的表達(dá)較 MOD組顯著下調(diào)(P ＜0.01),其中 DG組和 DZ組與 COLC組的 N F-κ B p65顯色指數(shù)的表達(dá)與 MOD組無(wú)明顯差異 (P＞ 0.05)。DD組 NF-κ B顯色指數(shù)與 M OD組比較無(wú)明顯差異(P ＞ 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 N F-κB p65免疫組化結(jié)果(±s;n=10)

表2 N F-κB p65免疫組化結(jié)果(±s;n=10)

注:*與 MOD組相比 P＜0.05,** 與 MOD組相比 P＜0.01,#與 COLC組相比 P＜ 0.05,## 與 COLC組相比 P ＜0.01。

實(shí)驗(yàn)表明 MOD組與 NOR組比較 Caspase-3免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高 (P ＜0.01)。與 MOD組比較 COLC組、DG組和 DZ組 Caspase-3顯色指數(shù)的表達(dá)較顯著下調(diào)(P ＜0.01),其中 DG組和 DZ組與 COLC組的 Caspase-3顯色指數(shù)的表達(dá)與 NOR組無(wú)明顯差異 (P＞ 0.05)。與MOD組比較 DD組 Caspase3顯色指數(shù)無(wú)明顯差異(P ＞ 0.05)。見(jiàn)表3。

表3 Caspase-3免疫組化結(jié)果(n=10)

2.3 RT-PCR結(jié)果

2.3.1 Bre對(duì)肝纖維化大鼠的 NF-κ B p65 mRN A表達(dá)的影響

表4、圖 1所示,與 NOR組比較 M OD組 NF-κB p65 mRN A表達(dá)顯著上調(diào) (P＜0.01);COLC組和 Bre各劑量組均能使 NF-κB p65 mRN A表達(dá)顯著降低 (P＜0.01)。DD組與 COLC組之間有顯著差異 (P ＜ 0.05)。DG、DZ組與 COLC組之間差異不顯著無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4,圖1。

圖1 N F-κ B凝膠電泳圖

表4 NF-ΚB mRN A的表達(dá)(n=10)

2.3.2 Bre對(duì)肝纖維化大鼠的 Caspase-3mRN A表達(dá)的影響

表5、圖 2所示與 NOR組比較 MOD組 Caspase-3 mRN A表達(dá)顯著上調(diào) (P＜0.01);COLC組與 Bre各劑量組均可以使 Caspase-3 mRN A表達(dá)顯著降低 (P＜0.01或P＜0.05)。COLC組與 DD、DG組之間有顯著差異(P ＜ 0.05)。見(jiàn)表5,圖 2。

圖2 Caspase-3凝膠電泳圖

表5 Caspase-3 mRN A的表達(dá) (n=10)

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中的 Caspase-3是 Caspase家族蛋白酶的一種,現(xiàn)在一般認(rèn)為 Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶,也是 HSC細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。Caspase-3在 HSC細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用[12,13],因此,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) Caspase-3的變化可作為判斷細(xì)胞凋亡干預(yù)措施是否有效的可靠指標(biāo),Caspase-3mRN A及蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。在靜止?fàn)顟B(tài)的 HSC及新鮮分離的 HSC核內(nèi)均缺乏 N F-κ B的核轉(zhuǎn)位活性,而活化狀態(tài)的 a-SM A陽(yáng)性的 HSC-出現(xiàn) NF-κB的核轉(zhuǎn)位活性。N F-κB可抑制HSC的 I型膠原基因轉(zhuǎn)錄[14]。隨著 HSCs的活化,激活的 NF-κB通過(guò)以抑制 HSC的凋亡而使其數(shù)量維持在一定水平,最終導(dǎo)致膠原合成的增加而發(fā)展成為纖維化[15]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 DG組、DZ組可以保肝降酶,防治肝纖維化。其可能的機(jī)制是:燈盞花素能降低 Caspase-3 mRN A及其蛋白的表達(dá),降低 N F-κB p65mRN A及其蛋白的表達(dá)。提示燈盞花素抗肝纖維化可能是從抑制星狀細(xì)胞激活、干預(yù)星狀細(xì)胞的凋亡,減少 Caspase-3等 HSC的細(xì)胞凋亡因子,通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制肝臟星狀細(xì)胞的激活,進(jìn)而使膠原分泌減少、降解增加,使肝內(nèi) ECM沉積減輕等方面來(lái)抗肝纖維化。

[1] 俞宏淵,陳宗蓮.燈盞細(xì)辛的家化栽培 [J].云南植物研究,2002,24(1):115

[2] 中國(guó)科學(xué)院植物研究所主編.中國(guó)高等植物圖鑒 [M].第 4冊(cè).北京:科學(xué)出版社,1972,444-445

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典 [M].上冊(cè).上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1985,948-949

[4] 孟慶媛,林明華.燈盞花素干預(yù)大鼠肝星狀細(xì)胞 TGFβ1、α-SM A表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2011,31(23):4618-4620

[5] Ahern M, Hall P,Halliday J. Hepatic stellatecells narenclature(letter)[J].Hepatology,1996,23(1):193

[6] Miyahara T,Schrum L,Rippe R,et al.Peroxisome proliferatoractuated receptors and hepatic stellate cell activation[J].J Biol Chem,2000,275(46):35715-35722

[7] Gressner AM.Cytokines and cellular crosstalk involved in the activation of fat-storing cells[J].Hepato1,1995,22(2):28-36

[8] Oakley F,Mann J,Ruddell Rq,et al.Basal expression of Ikappa Balpha is controlled by the mammalian transcriptional repressor RBP-J(CBF1)and its activator Notchl[J].J Biol Chem,2003,278(27):24359-24370

[9] Muhlbauer M,Weiss TS,Thasler WE,et al.LPS-mediated Nfkappa B activation varies between activated human hepatic stellate cells from different donors[J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,325(1):191-197

[10] Rus C,Gores GJ.Apoptosis and liver disease[J].Am JM ed,2000,108:567-574

[11] 張曉田.Caspasee-3與細(xì)胞凋亡的研究 [J].醫(yī)學(xué)綜述,2002,8:621-623

[12] 彭黎明,王曾禮.細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)與臨床 [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000,112-114,394-405

[13] Canbay A,Friedman S,Gores GJ.Apoptosis: the nexus of liver injury and f1brosis[J].Hepatology,2004,39:273-278

[14] Zhao YZ,Kim JY,Park EJ,et al.Tetrandrine induces apoptosis in hepatic stellate ce11[J].Phytotlier Res,2004,18(2):306-309

[15] Hellerbrand C,Jobin C,Lieato LL.Cy to kines induce N F-Kappa B in activated but not quieseent rat hepatie stellate cells[J].Am J Physiol,1998,275:269-278