霍海峰,范宗憲,牟嘉礫,欒畢奇,勾 晶,白 潔

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科,黑龍江 佳木斯 154003)

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤,外科手術(shù)切除是治療喉癌的主要措施,自?shī)W地利醫(yī)師 Billroth第一例全喉切除術(shù)成功問(wèn)世,經(jīng)歷一百多年的發(fā)展,方法不斷的改進(jìn),手術(shù)模式既要徹底切除腫瘤,又要保留正常喉黏膜組織,重建呼吸、飲食和發(fā)音功能,所以手術(shù)安全切緣定位成為臨床治療成功與否的重要指南。目前,臨床把喉癌旁5mm作為手術(shù)的安全切緣仍留有爭(zhēng)議。我們采用應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法,對(duì)喉鱗癌和癌旁不同切緣組織中的 M TA-2mRN A表達(dá)情況,從分子水平的角度探討手術(shù)安全切緣,為臨床喉癌手術(shù)的定界提供有價(jià)值的理論客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本與病人資料

我們收集自 2010-01～ 2011-01佳木斯大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科30例住院患者首次手術(shù)切除的新鮮喉鱗癌及癌旁喉組織,分別取材于癌中心和距離癌緣2mm、5mm、10mm的組織,并以標(biāo)記。30例患者均未曾接受過(guò)放、化療,且病理報(bào)告為鱗狀細(xì)胞癌。男 27例,女3例;中位年齡 58歲。按照 International Union Against Cancer(UICC)于2002年修訂的腫瘤 pTNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ 期22例,Ⅱ期8例,喉鱗癌中高分化10例,中分化13例 ,低分化7例,全部患者臨床資料完整,均無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2 RT-PCR檢測(cè)方法

采用 Trizol試劑(Invitrogen公司 )提取組織總 RNA,利用 RN A PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒 (TaKaRa公司)進(jìn)行 RT- PCR。MTA - 2引 物 序 列: 5-TGTACCGGGTGGGAGATTAC - 3, 5 -TGAGGCTACTAGAAATGTCCCTG-3,產(chǎn)物長(zhǎng)度153bp,復(fù) 性 溫 度 53℃。β - actin 引 物 序 列: 5-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC - 3, 5 -AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3,產(chǎn)物長(zhǎng)度 308bp,復(fù)性溫度55℃。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,BioImaging System采集圖像并分析 ,以β-actin為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS for Windows 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差± s)來(lái)表示,采用 t檢驗(yàn)。P ＜ 0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 喉癌及癌旁不同距離組織中 M TA-2的 mRN A表達(dá)

喉癌組織中 M TA-2的 mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織,而不同距離癌旁組織中 M TA-2的 mRNA表達(dá)也有差異。見圖1:A,B,C,D分別表示癌旁10mm,5mm,2mm及喉癌組織中 MT A-2的 mRNA表達(dá)情況。β-actin為內(nèi)參照。

2.2 喉癌及癌旁不同距離組織中 M TA-2mRNA表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析

喉癌組織中 M TA-2 mRN A的平均灰度值為0.96±0.12,癌旁2mm組織的灰度值為0.74± 0.09,明顯低于喉癌組織中的表達(dá) (P＜0.05);癌旁5mm組織中 M TA-2的灰度值為 0.43±0.06,也明顯低于癌旁2mm組織中的表達(dá) (P ＜0.05),而癌旁10mm組織中 M TA-2的灰度值為0.39±0.08,與癌旁 5mm組織沒有顯著差異 (P＞ 0.05)。

圖1 M TA-2在喉鱗癌組織及癌旁組織中 mRN A的表達(dá)

3 討論

M TA- 2基因 是 屬于 metastasis- associated gene(M TAs)家族成員之一,是1998年 Zhang Y等[1]首先發(fā)現(xiàn)的。M TA-2是一個(gè)分子量為70kDa,編碼668個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì),人 M TA-2基因位于染色體 11q1213.1。目前認(rèn)為M TA-2參與組成具有核小體重塑活性的組蛋白脫乙酰基酶 (nucleosome remodeling deac-etylase,NuRD)的 亞基 ,并與生物個(gè)體的發(fā)育密切相關(guān)。此外,文獻(xiàn)報(bào)道 M TA-2可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、細(xì)胞凋亡和雌激素通路等途徑而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[2～4]。更為重要的是,M T A-2的表達(dá)在腫瘤和腫瘤來(lái)源的正常上皮組織之間存在差異,并且 M TA-2的表達(dá)與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度密切相關(guān)。我國(guó)自1975年山東醫(yī)科大附屬醫(yī)院開展次全喉切除術(shù)以來(lái),隨著分子生物學(xué)的不斷深入研究及外科修復(fù)技術(shù)的不斷完善,各類功能性喉部分切除術(shù)已應(yīng)用于臨床實(shí)踐中,其目的是即根治腫瘤保證患者的生存率,又保留喉正常功能,提高生活質(zhì)量。喉部功能性手術(shù)方式很多種,但最終是根據(jù)病變部位根治腫瘤,對(duì)喉功能進(jìn)行最大可能的從建和修復(fù)。因此,對(duì)手術(shù)的安全切緣定位更顯得重中之重。目前眾多文獻(xiàn)提示把癌旁5mm作為保證預(yù)后和防止復(fù)發(fā)的手術(shù)安全界限,均是以病理組織形態(tài)學(xué)檢查作為依據(jù)。隨之有相關(guān)報(bào)道,以切緣陽(yáng)性的喉癌手術(shù)后復(fù)發(fā)率為33.3%,陰性的為5.8%。原因可能檢測(cè)切緣組織中的微轉(zhuǎn)移灶在分子水平上發(fā)生了變化但其細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)可能正常。因此,喉癌的安全切緣的正確判定是非常重要的。

本研究從分子水平檢測(cè)了癌中心和癌旁不同距離的切緣組織 M TA-2的 mRN A表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)喉癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織,從癌旁2～ 5mm時(shí) M TA-2的 mRN A表達(dá)是逐漸降低的,而癌旁 10～ 5mm相比 M TA-2的mRN A表達(dá)沒有顯著差別,說(shuō)明癌旁5mm處 M TA-2的表達(dá)已處于正常水平。而癌旁小于5mm的組織雖然組織學(xué)上可無(wú)病理改變但在基因表達(dá)上可能異常,具有潛在的危險(xiǎn)性。而癌旁5mm以外的區(qū)域 M TA-2的表達(dá)已處于穩(wěn)定狀態(tài)而沒有繼續(xù)下降,因此喉癌手術(shù)中切除腫瘤的范圍應(yīng)包括距腫瘤邊界5mm處的癌旁組織,這樣既可有效地切除腫瘤組織并防止復(fù)發(fā),而且也能最大限度地保留患者的喉功能并減少手術(shù)帶來(lái)的后期生活質(zhì)量的顯著降低。

總之,在分子水平的基礎(chǔ)上檢測(cè) M TA-2mRNA在喉癌及癌旁不同距離切緣組織的表達(dá),來(lái)研究喉癌手術(shù)的切緣定界范圍。希望今后能進(jìn)一步研究發(fā)生于不同解剖部位的喉癌中 M TA-2 mRNA與其浸潤(rùn)性之間的相關(guān)性,為喉癌手術(shù)的分子定界提供客觀而有價(jià)值的基礎(chǔ)資料。

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