楊 波，唐伏秋

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院腫瘤科1、干部病房二科2，湖北 武漢 430070）

膠質(zhì)母細胞瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，來源于神經(jīng)上皮組織，病理學(xué)分級屬WHOⅣ級星形細胞瘤。常見的發(fā)病年齡為45～65歲，老年男性多見，多以顱內(nèi)高壓癥狀或神經(jīng)功能障礙癥狀起病、病程短、進展快、死亡率高。雖然目前臨床上采用了手術(shù)為主，輔以術(shù)后放療、化療、免疫治療的綜合治療措施，但膠質(zhì)母細胞瘤的療效仍然不理想，患者生存期短，預(yù)后差。為了改善膠質(zhì)母細胞瘤患者的預(yù)后，延長生存期，必須深入研究膠質(zhì)母細胞瘤的增殖、侵襲的機制，尋找新的治療靶點?；|(zhì)金屬蛋白酶是一種鋅離子依賴的蛋白水解酶家族，可以降解細胞外基質(zhì)中的膠原、明膠、蛋白多糖、層粘連蛋白等多種成份，與結(jié)腸癌、肺癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤的增殖、侵襲密切相關(guān)[1-2]。為了解膠質(zhì)母細胞瘤中基質(zhì)金屬蛋白酶13(Matrix metalloproteinase-13，MMP-13)的表達及其與患者術(shù)后生存期之間的相關(guān)性，我們采用免疫組化學(xué)法檢測了31例膠質(zhì)母細胞瘤患者組織標(biāo)本中MMP-13的表達，比較MMP-13強表達組與弱表達組患者術(shù)后生存期的差異，報道如下：

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院2008年1月至2010年6月首次手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實的膠質(zhì)母細胞瘤患者的石蠟組織標(biāo)本31例，所有病例均系廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)外科住院患者，經(jīng)過影像學(xué)及術(shù)后病理確診為膠質(zhì)母細胞瘤，術(shù)前均未行放療、化療和免疫治療等抗腫瘤治療。其中男20例，女11例，年齡33～65歲，平均51.6歲。電話隨訪患者的生存期，隨訪日期截止至2011年6月1日。

1.2 主要試劑 小鼠抗人MMP-13單克隆抗體購自美國Abnova公司，即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色試劑盒等試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 方法 采用免疫組化兩步法：以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS沖洗3次，每次3 min。高壓鍋煮沸對組織抗原進行修復(fù)，每張切片加1滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl的小鼠抗人MMP-13單克隆抗體，4℃過夜。PBS液洗3遍，每次3 min，每張切片加1滴或50 μl即用型MaxVisionTM試劑，室溫下孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察1～3 min掌握顯色程度。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。之后切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 MMP-13染色結(jié)果判定 MMP-13陽性表達的細胞中，胞漿呈程度不同、基本均勻的棕黃色顆粒反應(yīng)，強表達者呈黃褐色。由兩名獨立的病理科醫(yī)師根據(jù)組織切片的染色強度和染色面積進行半定量染色評分，染色強度的評分標(biāo)準(zhǔn)是：0=陰性，1=弱陽性，2=陽性，3=強陽性；染色面積的評分標(biāo)準(zhǔn)是：0=陰性，Ⅰ＜10%，Ⅱ 10～50%，Ⅲ＞50%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，術(shù)后生存期的比較用Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MMP-13在膠質(zhì)母細胞瘤組織中的表達 如圖1所示，MMP-13在膠質(zhì)母細胞瘤標(biāo)本組織中的表達主要集中在腫瘤細胞的細胞漿，顯微鏡觀察呈程度不同的黃色、黃褐色染色。31例膠質(zhì)母細胞瘤標(biāo)本按照Tirapelli等[3]報道的膠質(zhì)母細胞瘤免疫組化評分方法（詳見材料與方法1.4）判定染色評分，將染色強度與染色面積評分相加，總評分0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強陽性。其中MMP-7陰性表達7例，弱陽性表達8例，陽性和強陽性表達16例，總表達率（弱陽性表達組+陽性表達組+強陽性表達組）達77.4%。強表達組（陽性表達組+強陽性表達組）16例，占51.6%。弱表達組（陰性表達組+弱陽性表達組）15例，占48.4%。

圖1 免疫組化檢測膠質(zhì)母細胞瘤組織MMP-13的表達(×200)

2.2 MMP-13表達的強弱與患者術(shù)后生存期的關(guān)系 31例膠質(zhì)母細胞瘤患者中，MMP-13強表達組16例，刪除1例（患者仍生存）。MMP-13弱表達組15例，刪除3例（患者仍生存）。如圖2所示，MMP-13強表達組生存期明顯短于MMP7弱表達組（P＜0.0001，χ2=18.275)。

圖2 31例膠質(zhì)母細胞瘤患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

膠質(zhì)母細胞瘤是高度惡性的Ⅳ級星形膠質(zhì)細胞瘤，可以是顱內(nèi)原發(fā)，也可以由間變性星形細胞瘤進一步惡變而來，病理學(xué)又分為多形性膠質(zhì)母細胞瘤和巨細胞型膠質(zhì)母細胞瘤。膠質(zhì)母細胞瘤鏡下可見瘤細胞密集，有明顯異型性，常常伴出血、壞死，血管內(nèi)皮細胞明顯增生。腫瘤發(fā)展迅速，預(yù)后差，患者多在兩年內(nèi)死亡[4]。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移通常包括以下三個步驟：①腫瘤細胞粘附基底膜和細胞外基質(zhì)，通過各種蛋白水解酶降解基底膜和細胞外基質(zhì)成份；②腫瘤細胞在各種趨化因子的作用下聚集和移行；③腫瘤細胞隨血管和淋巴管轉(zhuǎn)移至他處繼續(xù)增殖。其中，細胞外基質(zhì)的降解是惡性腫瘤侵襲的重要步驟，而基質(zhì)金屬蛋白酶在這一過程中發(fā)揮著重要作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶可以分為5個亞類：膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶和其他類[5]。MMP-13與MMP-1、MMP-8同屬于膠原酶亞類，是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中一個重要的成員，它主要由腫瘤細胞和腫瘤間質(zhì)細胞分泌，可以降解細胞外基質(zhì)中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原等成份。特別是Ⅱ、Ⅳ型膠原，是MMP-13的主要作用底物[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MMP-13的高表達與乳腺癌、結(jié)腸癌、軟骨肉瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。Zhang等[8]用免疫組化法檢測了263例乳腺癌石蠟包埋組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)MMP-13蛋白主要表達于腫瘤細胞的胞質(zhì)和腫瘤間質(zhì)細胞，MMP-13在腫瘤細胞的表達（P＜0.001）和腫瘤間質(zhì)成纖維細胞的表達（P＜0.001）都與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。MMP-13在腫瘤細胞的表達與Her-2(P=0.015）和TIMP-1（P＜0.010）的表達也密切相關(guān)。MMP-13在腫瘤細胞的表達還與腫瘤的侵襲性表型密切相關(guān)。高水平表達的MMP-13與患者的不良預(yù)后有關(guān)，MMP-13是決定乳腺癌患者預(yù)后和生存的獨立因素。Elke等[9]用半定量RT-PCR法檢測了30例結(jié)腸癌組織和遠端正常腸黏膜組織中MMP-13表達，發(fā)現(xiàn)MMP-13 mRNA在腫瘤組織中的表達遠遠高于在正常腸黏膜組織中的表達（P=0.023）。Curran等[10]用免疫組化法檢測了90例Dukes'C結(jié)腸癌患者腫瘤組織中MMP-13的表達，發(fā)現(xiàn)MMP-13的表達強弱與患者的術(shù)后生存期呈反比，MMP-13是決定結(jié)腸癌患者預(yù)后和生存的獨立因素。

雖然MMP-13在乳腺癌、結(jié)腸癌、軟骨肉瘤中的表達與患者預(yù)后和生存密切相關(guān)，但其在膠質(zhì)瘤中的表達研究資料尚不多。本研究結(jié)果顯示，MMP-13在膠質(zhì)母細胞瘤組織中總表達率為77.4%，Kaplan-Meier生存曲線分析和Log-rank檢驗比較，MMP-13強表達組術(shù)后生存期明顯低于弱表達組，這表明MMP-13在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達可能與腫瘤的惡性增殖、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)，并影響膠質(zhì)母細胞瘤患者的預(yù)后和術(shù)后生存。對于其通過影響哪些靶分子或靶基因來促進膠質(zhì)母細胞瘤的增殖和侵襲，還有待于進一步的實驗研究。

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