王槐棟，胡 亞，張曉天，王冀邯，黃紅蘭，王 放，倪朝輝

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021）

近年來(lái)，由于抗菌藥物的廣泛使用致耐藥性細(xì)菌的種類和數(shù)量不斷產(chǎn)生、增加[1]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）為革蘭陰性菌產(chǎn)生的能使第三代頭孢菌素及單環(huán)內(nèi)酰胺類抗菌藥物分解失效的酶，是造成細(xì)菌耐藥性上升的重要原因。耐藥菌株的代表為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[2-3]。耐藥菌株的出現(xiàn)使臨床抗感染治療面臨新的難題，因此尋找更有效的藥物和治療方法迫在眉睫[4]。中成藥銀花泌炎靈片臨床應(yīng)用證明具有良好的治療急性尿路感染、急性腎盂腎炎、慢性前列腺炎的作用[5-7]。但該藥對(duì)產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌是否有明確療效尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本文就銀花泌炎靈片對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的體外抑菌活性進(jìn)行研究，為臨床應(yīng)用抗菌中藥制劑治療產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌引起的感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

生物安全柜（AIRTECH BHC-1300ⅡA/B）、紫外分光光度計(jì)（UNIC UV-2800AH）。VITEK-32型全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國(guó)生物-梅里埃公司）。

1.2 藥品與試劑

藥敏紙片（英國(guó)Oxiod公司），銀花泌炎靈片（吉林華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：101215規(guī)格05g×24s/盒），雙黃連膠囊（河北奧星集團(tuán)藥業(yè)有限公司），營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，批號(hào)：20050110）。

1.3 菌株來(lái)源

質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922（不產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌）和大腸埃希菌ATCC35218（產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌）。40株大腸埃希菌臨床株分離自臨床住院患者，并經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定確認(rèn)。參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所CLSI2009版推薦的方法進(jìn)行產(chǎn)ESBLs菌株的初篩及確認(rèn)，其中18株確定為產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌。

1.4 藥敏試驗(yàn)

所有產(chǎn)ESBLs菌株采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照CLSI2009 版標(biāo)準(zhǔn)判定敏感、耐藥和中介。

1.5 銀花泌炎靈片體外抑菌試驗(yàn)

采用2倍平板稀釋法測(cè)定銀花泌炎靈片制劑的最小抑菌濃度（MIC）。制備含待測(cè)藥物的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，藥物終濃度分別為25、50、100、200、400 mg/mL。復(fù)蘇菌株，并在MH肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為600 nm的條件下將MH肉湯中菌液的OD值調(diào)整到0.1～0.2之間，菌液濃度為108/mL。取100 μL菌液滴加在不同藥物濃度的培養(yǎng)皿和空白培養(yǎng)皿上，37℃孵箱孵育過(guò)夜。完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為被檢菌的最低抑菌濃度（MIC），分別檢測(cè)銀花泌炎靈片對(duì)18株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌、對(duì)照組大腸埃希菌ATCC25922和大腸埃希菌ATCC35218的MIC。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

40株大腸埃希菌臨床分離株中檢出產(chǎn)ESBLs菌株為18株（45.0%），藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示18株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌全部為多重耐藥菌株，除對(duì)亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸及頭孢西丁尚較敏感外（耐藥率均低于30%），對(duì)其他臨床常用抗菌藥物如頭孢呋辛、頭孢克洛、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松等耐藥率均超過(guò)70%，對(duì)氨芐西林和頭孢唑啉的耐藥率達(dá)到100%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 18株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥情況（例，%）

2.2 銀花泌炎靈片的抑菌活性

銀花泌炎靈片對(duì)18株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌臨床株及質(zhì)控菌對(duì)照株ATCC25922和ATCC35218的MIC范圍均在100 mg/mL-200 mg/mL之間，各組別抑菌活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

細(xì)菌耐藥性已成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和生態(tài)學(xué)問(wèn)題，濫用抗生素與其直接相關(guān)[8]。本研究從40株大腸埃希菌臨床分離株中鑒定出18株產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌，且它們對(duì)臨床一線用藥如：氨芐西林、頭孢唑啉、哌拉西林、頭孢呋辛酯、復(fù)方新諾明、頭孢克洛、左旋氧氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松等都產(chǎn)生了超過(guò)80%的耐藥情況。ESBLs是絲氨酸蛋白酶的衍生物，它的出現(xiàn)是由于β-內(nèi)酰胺酶上1～4位點(diǎn)氨基酸發(fā)生了突變，可以通過(guò)質(zhì)粒傳播。在臨床分離的菌株中，由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥比由染色體介導(dǎo)的耐藥多，它可在不同菌株、菌種或菌屬間轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。突變產(chǎn)生的ESBLs抗藥譜擴(kuò)大，且在ESBLs的質(zhì)粒上常攜帶對(duì)其他抗生素如氨基糖苷類及氟喹諾酮類的耐藥基因，故呈多重耐藥性[9-10]。西藥存在副作用、價(jià)格高等問(wèn)題，使用受到限制，尋找并研制對(duì)耐藥菌具有抗菌作用的中藥具有重大意義。

在對(duì)抗生素耐藥日益嚴(yán)重的今天，中藥抑菌的重要作用被人們?cè)絹?lái)越關(guān)注。金銀花具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用[11]；半枝蓮揮發(fā)油有一定抑菌作用，而且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌G+菌的抑菌效果強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性菌G-菌的抑菌效果[12]。根據(jù)美國(guó)學(xué)者ZhaoX和Kari Drlica的突變選擇窗理論，減少細(xì)菌突變菌株選擇性富集，防止耐藥發(fā)生的方法有：（1）選擇低防突變濃度，窄突變選擇窗濃度的藥物；（2）使抗菌藥物濃度快速達(dá)到防突變濃度之上，減少藥物濃度落入突變選擇窗內(nèi)的時(shí)間，但是這種方法可選擇的藥物有限，大多數(shù)抗菌藥物的防突變濃度比較高，增大藥物劑量則可能增加藥物的不良反應(yīng)。（3）通過(guò)聯(lián)合使用抗菌藥物，降低藥物的防突變濃度縮小突變選擇窗[13]。而中藥正是因?yàn)槠浜卸喾N相互作用的化合物，對(duì)細(xì)菌的繁殖起到影響，使細(xì)菌不能針對(duì)某一種抑菌機(jī)制產(chǎn)生抑制作用從而對(duì)某種藥物產(chǎn)生耐藥性。

本研究中的銀花泌炎靈片是以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，以地道中藥材為原料，采用現(xiàn)代先進(jìn)工藝精制加工而制成的純中藥制劑。銀花泌炎靈片由金銀花、半枝蓮、萹蓄、淡竹葉、燈心草、石韋、桑寄生等十味中藥材組成，具有清熱解毒、利濕通淋之功效，臨床主要用于急性腎盂腎炎，急性膀胱炎等癥。文獻(xiàn)報(bào)道其具有良好的治療急性尿路感染、急性腎盂腎炎、慢性前列腺炎等[6-7]等作用。

有報(bào)道稱中藥可以使耐藥的大腸埃希菌失去耐藥性，其逆轉(zhuǎn)程度和藥物濃度及培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)[14]。所以用中藥代替抗生素治療耐藥菌株感染為一種值得推廣的方法。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明臨床常用抗生素廣泛耐藥的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌對(duì)中藥制劑銀花泌炎靈片并不產(chǎn)生明顯的耐藥性。說(shuō)明中藥制劑的抑菌機(jī)制與化學(xué)抗菌藥物不同，且不受細(xì)菌耐藥質(zhì)粒及耐藥基因的影響。因此，利用抗菌中藥解決產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥問(wèn)題，可為臨床應(yīng)用抗菌中藥治療產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]古東東,段蘊(yùn)鈾,張紅鷹,等.臨床標(biāo)本細(xì)菌分離及細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2003,13(1):67-70.

[2]張 振,鮑連生,游上游,等.大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的探討[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(6):783-786.

[3]倪朝輝,李 凡.沈陽(yáng)地區(qū)兒科產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭陰性菌的耐藥性與基因型研究[J].中國(guó)抗生素雜志,2006,31(11):692-696.

[4]陶慶春,田歡棟.雙黃連粉針劑對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的體外抑菌作用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010,20(6):1 382-1 384.

[5]王冬梅,陳立軍,王曉婷.銀花泌炎靈片治療急性尿路感染30例臨床觀察[J].中醫(yī)藥信息,2006,23(3):28.

[6]王曉婷,許 晶,王冬梅.銀花泌炎靈片治療急性腎盂腎炎45例臨床觀察[J].中醫(yī)藥信息,2006,23(2):39.

[7]張福軍,劉曉芳.銀花泌炎靈片治療濕熱下注型慢性前列腺炎的臨床觀察[J].臨床醫(yī)藥實(shí)踐,2010,19(10):599-600.

[8]Harbarth S,Harris AD,Carmeli Y,et al.Parallel analysis of individualand aggregated data on antibiotic exposure and resistance in gram negative bacilli[J].Clin Inect Dis,2001,33(9):1 462-1 468.

[9]Bush K,Jacoby GA,Medeiros AA.A functional classif i cationscheme for β lactamases and correlaton with molecular structure[J].Antimicrob Agents Chemother,1995,39(6):1 211-1 233.

[10]Lu J,Chen SL,Dong J,et al.Enterobacteriaceac cloacaeset off infected in hospital[J]. Zhonghua Yixue Jianyan Zazhi(Chin J Med Lab Sci),1998,8(4):229.

[11]曲京峰,張少華.中藥學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1994:87.

[12]蔡 璇,彭 松,施金玲,等.五種中藥對(duì)139株微生物體外抗菌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].藥學(xué)服務(wù)與研究,2005,5(3):267-270.

[13]邵世峰.左氧氟沙星聯(lián)合阿米卡星對(duì)肺炎克雷伯菌耐藥突變選擇窗的影響[D].天津,天津醫(yī)科大學(xué),2010.

[14]盧亞軍.中藥逆轉(zhuǎn)大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酞胺類抗生素耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究[D].蘭州,蘭州大學(xué),2006.