方紅波，張水軍#，張 明，郭文治，張建軍，趙永福

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科;河南省肝移植中心;河南省高等學校肝膽胰外科與消化器官移植重點學科開放實驗室鄭州450052 2)上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院器官移植中心上海200127

膽管梗阻性黃疸是肝膽外科常見癥狀，可見于膽總管結石、膽管癌、胰頭癌等疾病。若梗阻得不到及時解除，可引發(fā)急性肝功能衰竭、膽汁性肝硬化等。約8%的梗阻性黃疸患者在圍手術期發(fā)生急性腎功能衰竭，發(fā)生急性腎功能衰竭后約68%的患者死亡［1］。缺血再灌注損傷可誘導急性腎功能衰竭。以往的研究［2-4］多關注于膽管梗阻對肝臟的影響，作者建立小鼠膽總管短暫梗阻(transient common bile duct obstrnction，TCBDO)模型和腎臟缺血再灌注(kidney ischemia-reperfusion，KIR)模型，觀察 TCBDO對腎臟和KIR的影響。

1 材料與方法

1.1 TCBDO模型的制備 用60 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射誘導麻醉小鼠，腹正中切口打開腹腔，暴露出肝門，用7-0帶針線縫扎膽囊管，并在胰腺上方打一活結，結扎膽總管，將松線端埋于皮下，雙層關腹。術后第2天將結扎線松開。膽總管結扎假手術(SHAM)不結扎膽總管，其余操作步驟同上。

1.2 KIR模型的制備 用60 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射誘導麻醉，將小鼠置于動物恒溫系統(tǒng)的加熱板上，置溫度感應探頭于肛門，維持體溫(36.0±0.5)℃。腹正中切口打開腹腔，將右側腎臟切除，游離出左側腎蒂，腹腔注射肝素鈉50 U/kg，用無損失微血管夾夾閉腎蒂25 min后，移去血管夾，然后雙層關腹，皮下注射0.5 mL生理鹽水，24 h后取血和腎標本。

1.3TCBDO后小鼠血清總膽紅素(TB)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和肌酐(Cr)水平的變化 取清潔級C57BL/6雄性小鼠30只，年齡8～12周，體質量20～28 g，自由進食水，制備TCBDO模型，術后第0、1、2、3、4 及 5 天，腹主動脈抽血約1 mL，分離血清測TB、ALT和Cr;并于術后第3、4及5天，取腎臟測HSP27蛋白的表達。每個時間點5只小鼠。以SHAM后第4天小鼠為對照。

1.4 TCBDO對小鼠KIR影響的觀察 另取40只小鼠，將按隨機數(shù)字表法分為4組，每組10只。SHAM+NOIR組:行SHAM且不做 KIR，于 SHAM后第4天抽血留標本;TCBDO+NOIR組:行TCBDO造模術不做KIR，第4天抽血留標本;SHAM+KIR組:行SHAM術后第4天行KIR造模術，缺血25 min灌注24 h后抽血留標本;TCBDO+KIR組:TCBDO造模術后第4天行KIR術，缺血25 min再灌注24 h后抽血留標本。血標本用于血清Cr水平測定。抽血后切取腎臟，用于HSP27蛋白、組織形態(tài)學、中性粒細胞浸潤程度和細胞凋亡檢測。

1.5 指標觀測方法

1.5.1 血清生化指標測定 采用西門子德靈自動生化儀測血清TB、ALT及Cr。

1.5.2 腎臟HSP27的表達 腎臟留取后凍存。用NE-PER核和胞質蛋白提取試劑(Thermo Scientific)提取總蛋白，使用100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，封閉后加兔抗鼠HSP27多克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)、抗β-actin小鼠單克隆抗體(碧云天生物技術公司)，二抗為抗兔、抗鼠多克隆抗體(Licor公司)。以目的蛋白與β-actin條帶光密度的比值為目的蛋白的相對表達量。

1.5.3 腎臟組織形態(tài)學觀察 腎臟標本于中性甲醛中過夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片，行過碘酸雪夫(PAS)染色。以半定量組織病理評分評估腎組織變化:正常為0分;異常變化＜25%計為1分;異常變化占25% ～為2分;50% ～為3分;75%～為4分。每個切片至少觀察3個視野(×400)。

1.5.4 腎臟中性粒細胞浸潤程度測定 采用髓過氧化物酶(MPO)法檢測。試劑購自Novus Biologicals公司。陽性細胞有棕黃色顆粒。每個切片至少觀察3個無重疊視野(×400)，根據(jù)陽性細胞計數(shù)的平均值評估中性粒細胞浸潤程度。

1.5.5 腎臟細胞凋亡測定 采用TUNEL法檢測，試劑購自Chemicon International公司。凋亡細胞呈棕褐色。每個切片至少觀察3個無重疊視野(×400)，計數(shù)凋亡細胞，以平均值評估細胞凋亡程度。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0處理數(shù)據(jù)，不同時間點TCBDO小鼠血清 TB、Cr、ALT及 HSP27蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗;4組小鼠腎組織病理評分和MPO陽性細胞數(shù)的比較采用非正態(tài)分布數(shù)據(jù)Kruskal-Wallis檢驗和Mann-Whitney檢驗，采用析因設計的方差分析比較4組小鼠血清Cr水平及腎組織凋亡細胞數(shù);檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1TCBDO 后小鼠血清 TB、ALT、Cr水平的變化TCBDO后各時間點小鼠血清TB、ALT、Cr測定結果見表1?？梢钥闯?，TCBDO后小鼠血清TB和ALT水平快速上升，此后迅速降低;血清Cr水平變化不大。

表1 TCBDO后小鼠血清TB、Cr、ALT的水平

2.2 TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白的表達TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白表達增強，見圖1和表2。

圖1 TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白的表達

表2 TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白的表達

2.3 TCBDO對小鼠KIR后血清Cr水平的影響見表3。

表3 TCBDO+KIR對小鼠血清Cr水平的影響(n=10)

2.4 TCBDO對小鼠KIR后腎組織的影響 見圖2。SHAM+KIR組:高倍鏡下可見廣泛的腎小管上皮細胞壞死，有炎癥細胞浸潤，腔內可見管型和壞死脫落的細胞，腎間質血管高度擴張充血，可見灶性出血，腎組織病理評分為(3.20 ±0.58)。TCBDO+KIR組:損傷程度減輕，大片壞死區(qū)明顯減少，僅見局灶性小管壞死，很少見管型和壞死細胞，間質充血、出血明顯減輕，腎組織病理評分為(2.10±0.52)。SHAM+NOIR組和TCBDO+NOIR組腎組織表現(xiàn)正常，腎組織病理評分均為(0.00±0.00)。4組腎組織病理評分差異有統(tǒng)計學意義(H=14.545，P=0.002)，TCBDD+KIR 組較 SHAM+KIR組明顯降低。

圖2 4組小鼠腎臟組織學表現(xiàn)(PAS染色，×400)

2.5 TCBDO對小鼠KIR后腎組織中性粒細胞浸潤的影響 MPO染色結果見圖3。SHAM+NOIR和TCBDO+NOIR組MPO陽性細胞數(shù)均為(0.00±0.00)，SHAM+KIR 和 TCBDO+KIR 組分別為(42.0 ±11.0)和(15.0 ±5.0)，4 組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(H=14.545，P=0.002)，TCBDO+KIR組較SHAM+KIR組明顯降低。

圖3 4組小鼠腎組織中性粒細胞浸潤情況(MPO染色，×400)

2.6 TCBDO對小鼠KIR后腎組織細胞凋亡的影 響 結果見圖4和表4。

圖4 4組小鼠腎組織細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

表4 TCBDO+KIR對小鼠腎組織細胞凋亡的影響

3 討論

膽總管梗阻可引起血清膽紅素升高。大量數(shù)據(jù)證實，膽紅素具有抗氧化和保護細胞的作用。微量的膽紅素可以減輕大鼠離體心臟的缺血再灌注損傷［4］。用膽紅素沖洗大鼠移植肝臟，能改善移植后肝臟的急性氧化應激和肝膽管功能障礙［5］。在內皮細胞中，膽紅素還可以抑制腫瘤壞死因子α激活核因子κB和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達［6］。該實驗中，小鼠膽總管短暫梗阻(TCBDO)術后血清TB、ALT水平先快速升高，后迅速下降，至術后第4天已降到正常水平;而血清Cr水平未發(fā)生明顯變化。因而，該實驗中，作者選擇在TCBDO術后第4天行KIR造模術，因此可忽略血清膽紅素對實驗結果的影響。

KIR損傷的一個重要特征就是中性粒細胞的聚集和浸潤;中性粒細胞通過ICAM-1和P-選擇素連接于血管內皮細胞，透過內皮細胞間隙游走到腎臟組織間隙;中性粒細胞產生和釋放的蛋白酶、細胞因子、活性氧和氮化物可對腎組織產生損傷［7］。該研究結果顯示，TCBDO后第4天行KIR，小鼠血清Cr水平、腎組織病理評分和中性粒細胞浸潤程度較單獨KIR術后明顯降低，同時細胞凋亡也明顯減少，說明TCBDO可減輕小鼠KIR損傷。HSP27是小分子熱休克蛋白，可由缺氧、缺血、高溫等各種應激因素誘導而高表達，以抵御應激造成的傷害。HSP27具有分子伴侶、抗細胞凋亡、抗氧化應激和抗炎的作用［8］。HSP27高表達的小鼠能更好地耐受腎臟、肝臟和心臟的缺血再灌注損傷［9-11］。該實驗中，作者發(fā)現(xiàn)，TCBDO后小鼠腎臟HSP27蛋白表達明顯增強。熱應激處理大量誘導的HSP27可阻礙大鼠心臟中血管緊張素Ⅱ誘導的白細胞介素-6(IL-6)和ICAM-1的表達，從而減輕血管緊張素Ⅱ誘導的心臟炎癥反應［12］。HSP27可通過P38-促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)刺激活化單核細胞產生IL-10［13］。IL-10能抑制多種炎癥細胞因子的合成和釋放，具有減輕KIR損傷的作用［14-15］。根據(jù)該研究結果，推測高表達的HSP27可能通過抑制內皮細胞ICAM-1的表達，從而阻礙中性粒細胞的聚集和浸潤;通過P38-MAPK途徑誘導單核細胞產生IL-10，減輕KIR損傷。

綜上所述，TCBDO影響了小鼠肝臟功能，并未影響到腎臟功能，而有可能作為誘導者，增強腎臟HSP27的表達，從而增強了腎臟抵抗傷害的能力。這可為防治梗阻性黃疸患者術后急性腎功能衰竭的發(fā)生提供參考，其明確的作用機制有待進一步研究。

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