陳 斌，陸 旭，周志強

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院血管外科鄭州450014

股動脈粥樣硬化是全身動脈粥樣硬化病變的重要組成部分。隨著生活水平的提高，動脈粥樣硬化所致的心腦血管和外周動脈硬化閉塞等疾病已經(jīng)嚴重威脅到人們的生命健康和生活質(zhì)量，研究動脈粥樣硬化的病因和發(fā)病機制，尋找血管粥樣硬化疾病的預(yù)防和治療措施成為迫切需要。脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)是能把脂肪酸從細胞膜轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)利用位點、在長鏈脂肪酸的代謝中起重要作用的一種低相對分子質(zhì)量的胞質(zhì)蛋白［1］。表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(E-FABP)是FABPs的一個亞型。脂肪酸合成酶(FAS)是多功能酶，參與軟脂酸的合成過程。研究［2］表明腺癌組織中E-FABP可能結(jié)合和轉(zhuǎn)運FAS合成的長鏈脂肪酸到細胞內(nèi)代謝位點。該研究旨在通過檢測人股動脈粥樣硬化斑塊組織中E-FABP、FAS蛋白及mRNA的表達情況，探討二者的表達變化在人股動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中可能的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2008年1月至2011年5月股動脈粥樣硬化斑塊剝脫術(shù)中獲取的內(nèi)膜標(biāo)本21例以及普外科外傷脾破裂脾切除術(shù)中脾動脈13例(對照組)。每位受試患者簽訂《股動脈粥樣硬化斑塊研究知情同意書》。術(shù)中獲取標(biāo)本后立即用PBS液洗去殘留血并簡單去除周圍組織后液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 兔抗人E-FABP單克隆抗體和兔抗人FAS單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，RT-PCR試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。E-FABP引物:正義鏈 5’-ACATGAAGGAGCTAG GAGT-3’，反義鏈 5’-TTCCCATCCCACTCCTGATGC-3’，擴增產(chǎn)物大小為245 bp;FAS引物:正義鏈5’-GACCGCTTCCGAGATTCCA-3’， 反 義 鏈 5’-CCT GAGGTCCCGAGATGGT-3’，擴增產(chǎn)物大小為415 bp;β-actin作為內(nèi)參照，正義鏈5’-GGAGTCCACTG GCGTCTT-3’， 反 義 鏈 5’-CATCATATTTGGCAG GTTT-3’，擴增產(chǎn)物大小為481 bp。SP900試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限工程公司);PCR儀(美國ABI公司);顯微成像系統(tǒng)(德國Lecia公司);Biosens Digital Imaging System v1.6圖像分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司);ImageQuant 100凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.3 組織形態(tài)分析 將標(biāo)本從液氮中取出后，經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋后，6 μm厚切片。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后進行HE染色。按病理分類標(biāo)準(zhǔn)［3］分為穩(wěn)定斑塊組(9例)、不穩(wěn)定斑塊組(12例)和對照組。

1.4 人股動脈粥樣硬化斑塊組織和脾動脈組織中E-FABP、FAS蛋白表達的檢測 采用SP法進行染色，具體步驟按SP900試劑盒說明書操作。陽性對照為已知的E-FABP和FAS蛋白染色陽性的組織切片，用PBS代替一抗作空白對照。顯微鏡下觀察，棕黃色顆粒為E-FABP或FAS陽性表達。每張切片取5個視野進行圖像采集，應(yīng)用Biosens Digital Imaging System v1.6測量計算所采集切片的陽性細胞的積分光密度值［4］，以5個視野的平均值表示該樣本被測蛋白的表達。

1.5 人股動脈粥樣硬化斑塊組織和脾動脈組織中E-FABP、FAS mRNA表達的檢測 取標(biāo)本(動脈及內(nèi)膜組織)50 g，勻漿后用Trizol試劑盒提取總RNA，用紫外分光光度儀測定其濃度和純度，然后進行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，ImageQuant 100凝膠成像系統(tǒng)成像，用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件分析電泳條帶，目的基因的相對表達量用各組目的基因與β-actin條帶灰度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0進行分析，3組E-FABP、FAS蛋白和mRNA表達的比較應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t法檢驗，應(yīng)用Pearson相關(guān)分析動脈粥樣硬化斑塊組織中E-FABP、FAS蛋白和mRNA表達的關(guān)系，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察 對照組脾動脈血管壁細胞排列整齊，血管內(nèi)膜、中膜、外膜完整，內(nèi)彈力層和外彈力層均清晰可見，內(nèi)皮細胞連續(xù)分布呈線狀。不穩(wěn)定斑塊組內(nèi)膜明顯增厚，細胞排列紊亂，內(nèi)皮細胞排列不完整，斑塊脂質(zhì)壞死核心面積超過斑塊面積的40%，斑塊內(nèi)見大量的泡沫細胞和炎性細胞，可見較多新生血管和膽固醇結(jié)晶，纖維帽較薄。穩(wěn)定性斑塊組脂質(zhì)壞死核心面積小于40%或沒有，泡沫細胞和炎性細胞少，纖維帽比較厚，有大量的鈣化灶。見圖1。

2.2 股動脈粥樣硬化斑塊和正常對照脾動脈組織中E-FABP和FAS蛋白表達比較 E-FABP和FAS棕黃色顆粒主要沉積在炎性細胞和泡沫細胞浸潤的區(qū)域。見圖2、表1。

表1 股動脈粥樣硬化斑塊和正常對照脾動脈組織中E-FABP和FAS蛋白表達比較

2.3 股動脈粥樣硬化斑塊和正常對照脾動脈組織中E-FABP和FAS mRNA表達比較 結(jié)果見圖3、表2。

2.4 相關(guān)性分析 不穩(wěn)定斑塊組中 E-FABP和FAS 蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.907，P=0.001)，EFABP和FAS mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.650，P=0.022);穩(wěn)定斑塊組中E-FABP和FAS蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.675，P=0.046)，E-FABP 和 FAS mRNA 表達呈正相關(guān)(r=0.778，P=0.014)。

圖3 股動脈粥樣硬化斑塊和正常對照脾動脈組織中E-FABP與FAS mRNA的表達

表2 股動脈粥樣硬化斑塊和正常對照脾動脈組織中E-FABP和FAS mRNA表達比較

3 討論

隨著生活水平的提高和人口老齡化，動脈粥樣硬化已成為嚴重威脅人民生命健康和生活質(zhì)量的疾病，下肢動脈粥樣硬化閉塞是全身動脈粥樣硬化的局部表現(xiàn)。研究［5-6］表明動脈粥樣硬化是血脂紊亂和炎癥反應(yīng)共同參與的慢性疾病，動脈粥樣硬化斑塊直接致血管腔狹窄和斑塊的破裂、出血，繼發(fā)血栓形成等。FABPs最基本的功能是參與脂肪酸從細胞膜轉(zhuǎn)運到脂肪酸在細胞內(nèi)被利用的位置的轉(zhuǎn)運。石玉榮等［7］研究表明FABP2 T基因增高2型糖尿病并發(fā)冠心病的遺傳易感性。Agardh等［8］研究顯示脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP)在人頸動脈粥樣斑塊中，特別是巨噬細胞中表達增高，E-FABP是FABPs家族中一員，且A-FABP 和 E-FABP 高度同源［9］。有學(xué)者［10］發(fā)現(xiàn)A-FABP促進動脈粥樣硬化發(fā)展的機制可能與炎癥因子、化學(xué)趨化因子有關(guān)。在巨噬細胞中，ox-LDL能誘導(dǎo)單核/巨噬細胞A-FABP mRNA和蛋白的表達［11］。長鏈脂肪酸可誘導(dǎo) FABP的表達［12］。該實驗結(jié)果顯示動脈粥樣硬化斑塊組中E-FABP蛋白及mRNA表達量高于對照組，且不穩(wěn)定斑塊組的表達量高于穩(wěn)定斑塊組，蛋白主要表達在炎性細胞和泡沫細胞浸潤的區(qū)域，提示從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，E-FABP的表達上調(diào)與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)，且與斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)，可能與膽固醇的轉(zhuǎn)運及炎癥反應(yīng)有關(guān)。作者推測在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，E-FABP可能通過長鏈脂肪酸、ox-LDL等物質(zhì)或其他途徑相互促進表達，高表達的E-FABP一方面將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運到巨噬細胞等脂肪酸利用場所，從而促使泡沫細胞的形成，另一方面FABP可能通過使炎癥因子或化學(xué)趨化因子表達增加及通過其他途徑產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成;炎癥細胞特別是巨噬細胞的活化可以滲入到纖維帽，降低纖維帽的張力，促使斑塊破裂，使斑塊趨于不穩(wěn)定。

FAS是催化合成長鏈飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶［13］，研究［14］表明粥樣斑塊脂肪酸并非單從食物中攝取，而可能部分在動脈內(nèi)合成，且由FAS介導(dǎo)合成的飽和脂肪酸在不穩(wěn)定斑塊內(nèi)的含量較高。張琴等［15］研究亦顯示上調(diào)FAS水平可導(dǎo)致宿主細胞脂質(zhì)沉積。Berndt等［16］研究表明炎癥因子IL-6與人群內(nèi)臟脂肪組織中的FAS基因表達量呈正比，可作為FAS表達的獨立預(yù)測因子。該研究顯示動脈粥樣硬化斑塊組中FAS蛋白及mRNA表達量高于對照組，且不穩(wěn)定斑塊組的表達量高于穩(wěn)定斑塊組，蛋白主要表達在炎性細胞和泡沫細胞浸潤的區(qū)域。推測動脈粥樣硬化過程中可能通過上調(diào)FAS的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平，使動脈內(nèi)飽和脂肪酸的合成增加，脂質(zhì)沉積，從而促使動脈粥樣硬化形成，而炎癥因子可能促進此過程。

相關(guān)性分析表明動脈粥樣硬化組織中E-FABP與FAS的表達呈正相關(guān)，說明E-FABP與FAS在動脈粥樣硬化形成過程中可能起協(xié)同作用。研究［5］表明乳癌組織中FABP5可能結(jié)合和轉(zhuǎn)運FAS合成的長鏈脂肪酸到細胞內(nèi)代謝位點。作者推測動脈粥樣硬化組織E-FABP的表達可能因FAS的過度表達而上調(diào)，可能作為FAS信號系統(tǒng)的下游信號分子，結(jié)合和轉(zhuǎn)運FAS的合成產(chǎn)物。

總之，人股動脈粥樣硬化斑塊中E-FABP與FAS的表達增高可能與人股動脈粥樣硬化的發(fā)生及斑塊不穩(wěn)定性有關(guān)，且E-FABP與FAS在斑塊中的表達呈正相關(guān)，E-FABP與FAS可能是聯(lián)系脂質(zhì)積累和炎癥的重要的因子，具體機制尚需要進一步探究。抑制E-FABP與FAS在動脈粥樣硬化斑塊中的表達可能為下肢動脈粥樣硬化及其他動脈粥樣硬化疾病的治療開辟新的領(lǐng)域，值得進一步研究。

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