嚴 琳，任景麗，楊鯤鵬，王立東

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院胸外科鄭州450014 2)鄭州大學第二附屬醫(yī)院病理科鄭州450014 3)河南省食管癌重點開放實驗室鄭州450052

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是世界上常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移率高、預后差及死亡率高的特點。骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP7)是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族中的一員［1］，具有調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學作用，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移中起重要作用［2-3］。作者采用免疫組化SP法檢測ESCC組織中BMP7蛋白的表達，RT-PCR法檢測BMP7 mRNA的表達，探討其與ESCC的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集鄭州大學第二附屬醫(yī)院2009年9月至2011年7月ESCC患者手術切除標本56例，每例標本于手術切除后取癌及距腫瘤邊緣＞5 cm的正常組織，凍存于－80℃冰箱中，均經(jīng)病理證實。患者術前均未行放化療或其他免疫治療。56例患者中，男51例，女5例，年齡43～79歲，其中＞60歲24例;組織學分級G1、G239例，G317例;腫瘤浸潤深度T1、T226例，T3、T430例;有淋巴結轉(zhuǎn)移33例，無23例;腫瘤分期按國際抗癌聯(lián)盟食管癌TNM分期標準(2009年第7版)，Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期35例。

1.2 主要試劑 免疫組化SP檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，鼠抗人BMP7單克隆抗體［生研(上海)生化試劑有限公司］，Trizol試劑(Invitrogen公司)，MMIV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)，PCR引物(北京賽百勝公司)。

1.3 ESCC組織中BMP7蛋白的檢測 采用鼠抗人BMP7單克隆抗體及免疫組化SP配套試劑盒檢測ESCC組織中BMP7蛋白的表達及分布。常規(guī)制片，4 μm厚石蠟切片，操作嚴格按照說明書進行，一抗按100倍稀釋。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。光鏡下，BMP7陽性信號主要位于胞膜和胞質(zhì)，表現(xiàn)為淺棕色至深棕色顆粒。于400倍鏡下選擇5個視野，計數(shù)陽性細胞，陽性細胞百分比≥20%即判定為BMP7蛋白表達陽性［4］。

1.4ESCC組織中BMP7 mRNA的檢測 提取標本總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此為模板，進行PCR擴增，以β-actin作為內(nèi)參。BMP7引物正義鏈:5’-GGTCATGAGCTTCGTCGTCAACC-3’，反義鏈:5’-GCAGGAAGAGATCCGATTCC-3’，產(chǎn)物大小 235 bp。β-actin引物正義鏈:5’-TGTATGCCTCTGGTCGTAC CAC-3’，反 義 鏈:5’-ACAGAGTACTTGCGCTCAG GAG-3’，產(chǎn)物大小592 bp。反應條件:預變性94℃5 min，變性94℃ 45 s，退火54℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，后延伸72℃ 5 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行分析。計算目的基因與β-actin條帶灰度值的比值，比值＞1即判定為目的基因mRNA表達陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)處理，采用配對χ2檢驗比較ESCC與正常食管黏膜組織中BMP7蛋白陽性表達率、BMP7 mRNA表達率以及ESCC組織中BMP7蛋白與mRNA表達之間的差異，采用行×列表資料的χ2檢驗比較ESCC組織中BMP7蛋白陽性表達與臨床病理特征之間的關系，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 ESCC和正常食管黏膜組織中BMP7蛋白的表達 見圖1、表1。

2.2 ESCC和正常食管黏膜組織中BMP7 mRNA的表達 見圖2、表2。

2.3ESCC組織中BMP7蛋白與mRNA表達的關系 見表3。

圖1 ESCC(A)和正常食管黏膜(B)組織中BMP7蛋白的表達(SP，×100)

表1 ESCC和正常食管黏膜組織中BMP7蛋白的表達

圖2 ESCC組織BMP7 mRNA RT-PCR擴增結果

表2 ESCC和正常食管黏膜組織中BMP7 mRNA的表達

表3 ESCC組織中BMP7蛋白與mRNA表達的比較

2.4 ESCC組織中BMP7蛋白表達與臨床病理特征的關系 ESCC組織中BMP7陽性表達與浸潤程度、淋巴結轉(zhuǎn)移及TNM分期有關，而與性別、年齡和組織學分級關系不大，見表4。

表4 BMP7蛋白表達與ESCC患者臨床病理特征之間的關系

3 討論

BMP7是TGF-β超家族的成員，存在于多種組織細胞中，通過與靶細胞表面的受體結合而發(fā)揮作用［5］。BMP7受體分為Ⅰ型和Ⅱ型，均屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶受體，BMP7首先與相應的Ⅱ型受體結合，再募集相應的Ⅰ型受體并使之磷酸化，作用于下游的Smad1、Smad5、Smad8 C-末端最后兩個絲氨酸殘基使其磷酸化，隨后作用于共同的對象Smad4，形成復合體并移入核內(nèi)，啟動特定的基因轉(zhuǎn)錄，引起相應的生物學效應。

結直腸癌組織中BMP7蛋白表達顯著高于癌旁組織［6］，BMP7蛋白的表達增加與結直腸癌浸潤深度顯著有關［7］。胃癌組織中BMP7蛋白的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移及靜脈侵襲有關［8］。在黑色素瘤的研究［9］中發(fā)現(xiàn)，BMP7高表達于惡性黑色素瘤細胞中，可能與促進黑色素瘤細胞的生長并增強其侵襲性，縮短復發(fā)時間有關。該研究證實ESCC組織中BMP7蛋白及mRNA的表達均較正常組織上調(diào)，提示BMP7可能是通過啟動其信號通路活性，使其表達上調(diào)，從而促使ESCC的發(fā)生。該研究結果還顯示，ESCC組織中BMP7蛋白與mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義，BMP7蛋白的表達與腫瘤TNM分期、浸潤深度及淋巴結轉(zhuǎn)移有關，這與Megumi等［10］的報道相似，表明BMP7陽性表達與ESCC的侵襲性、浸潤和遷移能力等有關聯(lián)。

然而，另外的研究結果卻截然不同，在腎細胞癌中BMP7的高表達與更好的外科預后相關［11］;在正常的前列腺腺體組織中BMP7表達水平較前列腺癌組織高，隨著前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，BMP7表達有逐漸降低的趨勢［12-14］;另外在骨髓瘤、乳癌的研究［15-16］中均證實BMP7具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。

上述研究結果表明，在不同的組織中BMP-7可能是通過與其受體結合后，調(diào)節(jié)其下游的信號通路，啟動不同的基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其不同的生物學效應。

總之，作者認為，BMP7在ESCC組織中表達升高，且與其TNM分期、浸潤及淋巴轉(zhuǎn)移有關，有望成為診斷ESCC的一種新的標記物。

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