張楠楠，潘衛(wèi)東，鄭國庭，李 靚，崔玉琳，秦 松，薛樂勛#

1)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州4500012)鄭州大學基礎醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室鄭州450001 3)寧波大學海洋生物技術重點實驗室寧波315211 4)中國科學院海洋研究所青島266071 5)中國科學院煙臺海岸帶研究所煙臺264003

二酰甘油?；D移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)是催化生物合成三酰甘油最后一步的關鍵酶，在動植物中普遍存在［1］。研究［2］表明:DGAT是三酰甘油生物合成途徑中惟一與三酰甘油合成速率保持一致的限速酶，其主要作用是催化二酰甘油加上酰基脂肪酸形成三酰甘油。DGAT1和DGAT2盡管在基因結構上有差異，但在生物合成三酰甘油中的作用相似，DGAT1在三酰甘油代謝中具有更廣泛的作用，而DGAT2更側重于特殊脂肪酸的積累，二者均能執(zhí)行三酰甘油合成途徑的最后一步［3］。微藻由于光合效率高、生物產量高、生長繁殖快、生長周期短和自身合成油脂能力強的特點被認為是生物柴油的巨大資源庫［4］。作者利用RT-PCR技術克隆了甘藍型油菜中已知的DGAT1和DGAT2基因的cDNA序列，并構建了以SV40啟動子驅動目的基因表達，以Bar基因作為篩選標記的微藻真核表達載體，探討以微藻生產生物柴油的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株和主要試劑 甘藍型油菜(Brassica napus)高油609為商品化種子，大腸桿菌 DH5α、pSV40rPA/CaMVBar系實驗室保存，pMD18-T Simple載體、限制性內切酶XhoⅠ和XbaⅠ及Taq DNA聚合酶均購自大連寶生物工程公司，RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，AMV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，凝膠回收試劑盒和質粒DNA提取試劑盒購自杭州維特潔生物公司。

1.2 目的基因DGAT1和DGAT2的擴增 取適量甘藍型油菜高油609種子萌發(fā)后10 d的葉片，用焦碳酸二乙酯處理的蒸餾水配制的PBS清洗3次，迅速置于液氮中充分研磨，利用Trizol試劑提取總RNA，通過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的完整性。以提取的甘藍型油菜總RNA為模板，按AMV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。依據(jù)GenBank中已知的甘藍型油菜DGAT1(登錄號 AF164434)和 DGAT2(登錄號AF155224)的序列設計引物。上游引物引入XhoⅠ酶切位點，下游引物引入XbaⅠ酶切位點，引物序列如下。DGAT1上游引物:5’-CCGCTCGAGATGGC GATTTTGGATTCT-3’，DGAT2 上游引物:5’-CCG CTCGAGATGTGTTGTCTCTCCCTT-3’，DGAT1 和DGAT2下游引物相同(5’-GCTCTAGATCAGGACAT GGATCCTTT-3’)。擴增條件:94℃預變性5 min;94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 100 s(DGAT1)或72℃70 s(DGAT2)，30個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃終止。反應結束后，PCR產物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 連接和測序鑒定 PCR產物經(jīng)凝膠回收后，連接到pMD18-T Simple載體上，轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，進行藍白斑篩選，挑取陽性菌落，通過菌液PCR進行鑒定。鑒定正確的陽性克隆由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果進行Blast比對分析。

1.4 DGAT真核表達載體的構建及鑒定 利用限制性內切酶XhoⅠ和XbaⅠ分別對pSV40rPA/CaMVBar、pMD18-T Simple/DGAT1 和 pMD18-T Simple/DGAT2進行雙酶切，分別回收載體片段和目的片段，16℃連接過夜，轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，得到重組的微藻真核表達載體pSV40DGAT1/CaMVBar和pSV40DGAT2/CaMVBar，并對質粒進行酶切鑒定。

2 結果

2.1 DGAT1和DGAT2基因RT-PCR擴增結果甘藍型油菜DGAT1和DGAT2基因經(jīng)RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分別檢測出在約1 500 bp和1 000 bp處有明顯亮帶(圖 1)，測序結果顯示DGAT1 為1 512 bp，DGAT2為1 026 bp，與GenBank中已知序列的同源性分別為99%和98%，得到的DGAT1和DGAT2基因是完整的編碼區(qū)序列。

圖1 甘藍型油菜DGAT1和DGAT2基因RT-PCR結果

2.2 pSV40DGAT1/CaMVBar 和 pSV40DGAT2/CaMVBar真核表達載體的鑒定 用XhoⅠ和XbaⅠ 對構建的 pSV40DGAT1/CaMVBar和pSV40DGAT2/CaMVBar載體進行雙酶切鑒定(圖2)，結果顯示載體構建正確。

圖2 pSV40DGAT1/CaMVBar和pSV40DGAT2/CaMVBar真核表達載體的鑒定

3 討論

微藻是一類系統(tǒng)發(fā)生各異、個體較小、通常為單細胞、能進行光合作用的水生低等植物，其每年吸收的CO2約占全球凈光合產量的40%，在能量轉化和碳元素循環(huán)中起到舉足輕重的作用，并且容易生長和收獲，產量很高［5］，許多科學家認為通過微藻來生產生物能源極具開發(fā)前途。

目前對轉基因擬南芥、大豆和煙草等物種的研究［6］表明，過量表達DGAT基因可以促進三酰甘油積累。已證明［7］啟動子CaMV35S和SV40在多種微藻中能夠有效驅動外源基因的表達，而Bar基因作為微藻中安全有效的篩選標記，也已經(jīng)被廣泛使用。

該實驗通過RT-PCR從甘藍型油菜中克隆得到DGAT1和DGAT2 cDNA編碼區(qū)序列，將其定向連接到真核表達載體上，構建出可轉化多種微藻的以SV40啟動子驅動目的基因DGAT1和DGAT2表達、以Bar基因作為篩選標記的pSV40DGAT1/CaMVBar和pSV40DGAT2/CaMVBar真核表達載體，為提高微藻油脂含量、進一步篩選出安全高效且適用于高油脂工程的藻種打下了基礎。

［1］Settlage SB，Kwanyuen P，Wilson RF.Relation between diacylglycerol acyltransferase activity and oil concentration in soybean［J］.JAOCS，1998，75(7):775

［2］Sukumar V，Sastry PS.Triacylglycerol synthesis in developing seeds of groundnut(Arachis hypogaea):studies on phosphatidic acid phosphatase and diacylglycerol acyltransferase during seed maturation［J］.Biochem Int，1987，14:1153

［3］王龍龍，彭振英，邵媛媛，等.植物二酰甘油?；D移酶基因(DGAT)研究進展［J］.西北植物學報，2009，29(9):1924

［4］韓笑天，鄭立，孫珊，等.海洋微藻生產生物柴油的應用前景［J］.海洋科學，2008，32(8):76

［5］Miyamoto K.FAO Agricultural Services Bulletin-128.Renewable biological systems for alternative sustainable energy production［M］.Rome:Food ＆ Agriculture Org，1997:3

［6］Colette Jako，Arvind Kumar，Yangdou Wei，et al.Seedspecific over-expression of an arabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight［J］.Plant Physiol，2001，126(7):861

［7］Zhang Y，Jiang P，Gao J，et al.Recombinant expression of rt-PA gene(encoding Reteplase)in gametophytes of the seaweed Laminaria japonica(Laminariales，Phaeophyta)［J］.Sci China C Life Sci，2008，51(12):1116