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        四種中藥對感染牙本質(zhì)小管糞腸球菌的抑制作用

        2012-06-19 09:49:42于靜胡永權(quán)王貴花戴東曉李君如謝景朝王榮霞趙發(fā)銀
        環(huán)球中醫(yī)藥 2012年1期
        關(guān)鍵詞:透光度水煎劑糞腸

        于靜 胡永權(quán) 王貴花 戴東曉 李君如 謝景朝 王榮霞 趙發(fā)銀

        糞腸球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)常見于口腔內(nèi)科根管治療失敗的再感染根管中。根 管 治 療 后 疾 病 (post-treatment endodontic disease,PED)患牙根管中糞腸球菌的感染率各學(xué)者的報道不一[1-4],但均認為PED患牙根管中糞腸球菌為優(yōu)勢菌。目前,臨床常用的根管消毒藥物在使用中或多或少存有欠缺,因此,需要尋找一種安全有效的根管消毒藥物來殺滅牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌。中藥具有獨特的消炎、殺菌和解毒等功效,且毒副作用小。本實驗選用黃連、五味子、大黃、連翹的水煎劑分別作為試驗藥物,以臨床常用的根管消毒藥甲醛甲酚 (formocresol,F(xiàn)C)作對照,在新鮮的離體人牙上觀察其對糞腸球菌的抑制作用,以期對四種中藥的抗糞腸球菌性能作初步評價,為臨床進一步研究提供一定參考。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        黃連、五味子、大黃、連翹水煎劑[四種中藥飲片各50g分別加500ml水,浸泡并經(jīng)兩次熬制濃縮成50ml,高壓滅菌得每毫升相當于原藥材1g(1∶1)的中藥水煎劑,待冷卻后置于4℃冰箱備用]。甲醛甲酚(FC)(武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔藥物材料廠,批號100525)。無菌生理鹽水(石家莊四藥有限公司,批號:101227407)。普通血瓊脂培養(yǎng)基(90mm,鄭州安圖綠科生物工程有限公司)。

        1.2 實驗設(shè)備

        電子分析天平(MA240D型,上海第二天平儀器廠);全自動立式蒸汽滅菌器(Model LS-B75L-Ⅱ,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(山東省濰坊醫(yī)療器械廠);數(shù)字顯示比濁儀(100%T,上海復(fù)星佰珞生物技術(shù)有限公司);一次性使用細菌培養(yǎng)皿(直徑為90mm,江蘇康健醫(yī)療用品有限公司);生物顯微鏡(OLYMPUS-212,日本奧林巴斯儀器公司);15#-40#H型根管銼(MANI.日本)。

        1.3 實驗菌種

        糞腸球菌(Enterococcus faecalis)臨床菌株1株,石家莊市第二醫(yī)院細菌室提供。

        1.4 實驗標本及分組

        選擇因正畸治療拔除的新鮮單根管牙84顆,冷凍-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩E懦荔w齲壞及髓或牙根面齲者、牙根不完整或牙根未發(fā)育完全,根尖孔未完全形成或敞開及牙根表面存在細小裂紋者。84顆離體牙分別編號,根據(jù)隨機數(shù)字表依次將牙齒分入陰性對照組、甲醛甲酚組、黃連水煎劑組、五味子水煎劑組、大黃水煎劑組、連翹水煎劑組、陽性對照組,共為7組,每組12顆。見表1。

        表1 7組牙根根管的處理情況

        1.5 實驗方法

        1.5.1 牙齒預(yù)備 將84顆離體牙浸泡于5.25%NaCl 0溶液,24小時后常規(guī)開髓、揭頂、去冠髓、拔髓,采取逐步后退法預(yù)備根管致40#大小,配以5.25%NaCl 0溶液與17%EDTA溶液交替沖洗及超聲蕩洗。用高速金剛砂車針去除牙齒冠部及根尖部,留取6mm高的柱狀牙根。將制備好的牙根置于含有25ml牛心腦浸液(BHI肉湯)的試管中,121℃高溫、高壓下滅菌15分鐘,置于5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi),24小時后觀察BHI肉湯無渾濁,以確定滅菌完全。

        1.5.2 制備標準菌液 復(fù)蘇并鑒定糞腸球菌,將其接種于BHI肉湯中,用比濁儀調(diào)整濁度為0.5M(透光度為80%T)的標準菌液備用。

        1.5.3 建立根管感染模型 將72顆牙根置于已制備的含糞腸球菌的菌液中,置于5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)(以利于糞腸球菌感染根管)。24小時后取出各牙根,用無菌生理鹽水蕩洗根管,無菌吸潮紙尖干燥根管,用蠟將牙根固定于一次性細菌培養(yǎng)皿的底部(注意底部根管口封閉完全)。

        1.5.4 放置根管消毒劑及檢測消毒效果 用一次性無菌注射器將藥劑按分組方法輸送至每顆牙根的根管內(nèi)(見表1)。將放置牙根的各組培養(yǎng)皿置于5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng),至第3天時每組各取出6顆牙根,去除根管內(nèi)試驗藥物,用無菌生理鹽水沖洗、無菌吸潮紙尖干燥后用慢速G鉆均勻磨取根管內(nèi)層牙本質(zhì)粉末,用電子天平稱取4mg,置于含有20ml BHI肉湯的無菌試管內(nèi),5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)72小時后取試管內(nèi)上層液體,比濁儀測量上層液體的透光度,并記錄數(shù)據(jù)。培養(yǎng)至第7天時取出每組剩余6顆牙根,作上述處理及檢測。透光度數(shù)值接近陰性對照者,證明其抑菌效果好;反之接近陽性對照者,其抑菌效果較差。在測量透光度的同時,各組分別取少量上層液體接種于普通血瓊脂培養(yǎng)基上,5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)48小時。進行快速革蘭染色,生物顯微鏡下鑒定BHI肉湯試管內(nèi)細菌的種類。鏡下觀察為G+球菌,呈橢圓形,符合糞腸球菌鏡下形態(tài),無其他細菌生長。證明實驗過程無污染。

        1.6 數(shù)據(jù)分析

        使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。因各組數(shù)據(jù)方差不齊且非正態(tài)分布,選擇秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 細菌培養(yǎng)3天時透光度比較

        7組培養(yǎng)物上層液體透光度比較,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黃連水煎劑組與甲醛甲酚組牙本質(zhì)小管中殘留細菌量較陽性對照組均明顯減少,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);兩者殘留的細菌量最少,差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);連翹水煎劑組與陽性對照組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);其余各組間差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

        2.2 細菌培養(yǎng)7天時透光度比較

        7組培養(yǎng)物上層液體透光度比較,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黃連水煎劑組與甲醛甲酚組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),該兩組與陰性對照組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但數(shù)值很接近;與陽性對照組有差別且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);連翹水煎劑組與陽性對照組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

        表2 各組根管不同處理方法抑菌效果比較(±s,﹪)

        表2 各組根管不同處理方法抑菌效果比較(±s,﹪)

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        3 討論

        糞腸球菌多存在于根管充填完善但仍有持續(xù)根尖損害的根管中,是導(dǎo)致根管治療失敗的主要病原菌。本研究參考Haapasalo及?rstavik的實驗方法[5]將糞腸球菌植入離體牙根管內(nèi),并模擬口腔溫度及厭氧環(huán)境進行培養(yǎng),制備感染根管內(nèi)牙本質(zhì)小管的體外模型,觀察臨床常用根管消毒藥物及四種中藥的抑菌效果。本實驗?zāi)鼙容^準確的模擬口腔內(nèi)環(huán)境,比較直觀的反映實際情況,所得結(jié)果可信且具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

        根管治療步驟包括根管預(yù)備、消毒和充填,有研究發(fā)現(xiàn)根管經(jīng)過預(yù)備后,雖然根管內(nèi)細菌的數(shù)量明顯減少[6],卻不能完全被殺滅。由此可見應(yīng)用有效的藥物消毒是很有必要的。而藥物消毒的效果則主要取決于根管消毒劑。因此,本實驗選用臨床常用并公認消毒效果較好的甲酫甲酚作為對照組,觀察黃連、五味子、大黃、連翹水煎劑對離體人牙根管內(nèi)糞腸球菌的抑菌效果,使實驗結(jié)果更直觀、更具說服力。

        為了更精確地反映中藥的抑菌作用 ,筆者還選擇了對腸球菌的體外抗菌活性檢測有較好的抑菌效果[7-9]的六種中藥(黃連、五味子、大黃、連翹、烏梅、黃芩),應(yīng)用M-H瓊脂進行了六種中藥對糞腸球菌抑菌活性的檢測,并選出其中抑菌效果較好的中藥黃連、五味子、大黃、連翹進行了對感染牙本質(zhì)小管糞腸球菌的抑菌實驗。實驗結(jié)果顯示黃連水煎劑對糞腸球菌的抑菌作用優(yōu)于其他參試中藥,其抑菌效果與甲酫甲酚無差別,考慮與黃連的主要抑菌成分黃連素(小檗堿)有關(guān)。黃連素具有廣譜抗菌作用,低濃度抑菌,高濃度殺菌。其作用機制可能是:(1)破壞細菌結(jié)構(gòu);(2)抑制細菌糖代謝,黃連能抑制酵母菌及細菌糖代謝的中間環(huán)節(jié)丙酮酸的氧化脫羧過程;(3)抑制核酸、蛋白質(zhì)合成。兩種實驗結(jié)果的一致性進一步證明了黃連有很好的抑制糞腸球菌作用,具備成為新的根管消毒藥物的潛能。且中藥水煎劑制備相對簡便,毒副作用小,不易產(chǎn)生耐藥性,因此進一步將其用于臨床是十分經(jīng)濟和安全有效的。

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