趙立榮，葛建軍，王衛(wèi)芳，古少常，張永瑜，胡學(xué)難，馮黎霞，吳海榮

(1廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州510623;2中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫研究所，北京100029;3高明出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東高明528500)

劍線蟲(chóng)Xiphinema Cobb，1913隸屬于矛線目Dorylaimida Pearse，1942，長(zhǎng)針科 Longidoridae(Thorne，1935)Meyl，1961，劍亞科 Xiphinematinae Dalmasso，1969.劍線蟲(chóng)是一類重要的植物外寄生線蟲(chóng)，可寄生于植物根部，影響根系長(zhǎng)勢(shì)，甚至造成根部腫大或壞死等癥狀.2010年4月，廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心接受高明出入境檢驗(yàn)檢疫局送檢的采自日本羅漢松根際的2份土壤樣品.從樣品中分離獲得劍線蟲(chóng)，經(jīng)形態(tài)觀察、測(cè)量，以及 rDNA-ITS、D2D3區(qū)擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析，分別鑒定為短頸劍線蟲(chóng)Xiphinema brevicollum Lordello et Da Costa，1961和喜馬拉雅劍線蟲(chóng)X.himalayense Ahmad，Lamberti，Rawat，Agostinelli et Srivastava，1998.短頸劍線蟲(chóng)在10 多個(gè)國(guó)家有發(fā)生［1］，F(xiàn)ritzsche等［2］曾報(bào)道在實(shí)驗(yàn)室條件下短頸劍線蟲(chóng)傳播番茄環(huán)斑病毒，但是Trudgill等［3］認(rèn)為其傳毒證據(jù)不充分;喜馬拉雅劍線蟲(chóng)僅報(bào)道印度境內(nèi)的加瓦爾喜馬拉雅山上海拔1 850 m處野草根際［4］，其傳毒能力有待進(jìn)一步考證.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和線蟲(chóng)的分離

采集羅漢松根際土壤，將土壤樣品淺盤(pán)浸泡10～24 h，用線蟲(chóng)篩分離線蟲(chóng).

1.2 線蟲(chóng)形態(tài)鑒定

分離獲得的線蟲(chóng)60～62℃水浴處理2～3 min，將線蟲(chóng)殺死，用FG固定液［V(甲醛)∶V(甘油)∶V(蒸餾水)=10∶1∶89)固定.在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察與測(cè)量.形態(tài)測(cè)計(jì)采用Deman公式中的參數(shù)符號(hào)［5］.

1.3 線蟲(chóng)分子鑒定

1.3.1 線蟲(chóng)DNA提取 在200 μL Eppendorf管中加入8 μL預(yù)冷的 PCR Buffer.在平玻片上滴20 μL ddH2O，挑入1條線蟲(chóng)，用手術(shù)刀將線蟲(chóng)切成2至多段，然后迅速吸取含盡量多的這些線蟲(chóng)片段的懸浮液 10 μL，加入含有 8 μL PCR Buffer液的 Eppendorf管中，再向管中加入2 μL預(yù)冷的1 mg/mL蛋白酶K，使總體積為20 μL.迅速將管放入-70℃冰箱至少10 min，而后將Eppendorf管置于PCR儀中65℃恒溫60 min，以降解DNase，接著95℃恒溫10 min，以變性蛋白酶K，此時(shí)即可取此DNA懸浮液1～2 μL直接做PCR或-20℃保存.

1.3.2 分子檢測(cè) ①PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系包括:10 × PCR Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，引物(10 μmol/L)1 μL，模板 DNA 4 μL，ddH2O 39.75 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，總體積50 μL.

②ITS區(qū)引物及擴(kuò)增程序.采用通用引物，上游引物為 5'-ttgattacgtccctgcccttt-3'，下游引物為 5'-tttcactcgccgttactaagg-3'［6］.擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min;4℃保溫.

③D2D3區(qū)引物及擴(kuò)增程序.采用通用引物，上游引物為5'-acaagtaccgtgagggaaagttg-3'，下游引物為5'-tcggaaggaaccagctacta-3'［7］，擴(kuò) 增 程 序 為 95 ℃3 min;95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min;4℃保溫.

④PCR產(chǎn)物的檢測(cè)及克隆、測(cè)序、系統(tǒng)進(jìn)化分析.使用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，電壓10 V/cm，取PCR產(chǎn)物5 μL上樣.電泳30 min后，在紫外燈下觀察.將片段割膠純化、回收，連接到pMD-18T載體后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Escherichia coli JM109菌株中，篩選陽(yáng)性菌落測(cè)序.以錢(qián)氏劍線蟲(chóng)X.chambersi作為外群，將獲得的序列數(shù)據(jù)與GenBank上相似性較高的美洲劍線蟲(chóng)序列進(jìn)行ME系統(tǒng)進(jìn)化分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 短頸劍線蟲(chóng)形態(tài)鑒定

雌蟲(chóng):熱殺死后蟲(chóng)體向腹面彎曲呈“C”形，兩端漸細(xì).唇區(qū)圓，縊縮明顯.齒尖針細(xì)長(zhǎng)、針狀、高度硬化，齒尖針基部呈叉狀，齒托基部呈顯著的凸緣狀;齒針導(dǎo)環(huán)為雙環(huán)，后環(huán)高度骨化，導(dǎo)環(huán)位于齒尖針后部靠近齒尖針與齒托相連接處.陰門(mén)位于蟲(chóng)體中部，橫裂，占陰門(mén)處體寬的1/3左右，子宮內(nèi)無(wú)特殊分化.生殖腺對(duì)生、均發(fā)育完全，生殖腺較短、卵巢回折.尾短圓錐形，有輕微指狀突起，尾長(zhǎng)等于或略長(zhǎng)于肛門(mén)處體寬(圖1A～1C).

圖1 短頸劍線蟲(chóng)(A～C)和喜馬拉雅劍線蟲(chóng)(D～F)形態(tài)特征圖Fig.1 Photomicrographs of Xiphinema brevicollum(A-C)and X.himalayense(D-F)

雄蟲(chóng):未見(jiàn).

幼蟲(chóng):蟲(chóng)體熱殺死后呈“C”形，彎曲程度小于成蟲(chóng).尾錐形，c'大于成蟲(chóng)，尾端尖圓，有輕微指狀突起.分離到1條幼蟲(chóng)(估計(jì)2齡或3齡):體長(zhǎng)988.1 μm，齒尖針長(zhǎng)60.3 μm，齒托長(zhǎng)38.9 μm，替代齒尖針長(zhǎng)71.2 μm，尾長(zhǎng)30.6 μm，a=35，b=4.6，c=32.0，c'=1.7.

短頸劍線蟲(chóng)形態(tài)測(cè)量值見(jiàn)表1.根據(jù)Lamberti等［10］檢索表，從日本羅漢松根際截獲的劍線蟲(chóng)特征代碼為 A3、B1、C2、D2/1、E2、F1、G2、H2、I2.除了 C值和I值偏大外，其他特征代碼都符合 Xiphinema diffusum Lamberti＆ Bleve-Zacheo，1979.該線蟲(chóng)的鑒定特征及測(cè)量值與Lamberti等［8］對(duì)X.diffusum的描述基本相符，只是尾偏長(zhǎng)，但差異不大.

另外，鑒于彌散劍線蟲(chóng)X.diffusum和短頸劍線蟲(chóng)X.brevicollum的多個(gè)鑒定特征及測(cè)量值(表1)交叉重疊，根據(jù) Luc等［9］觀點(diǎn)，將 X.diffusum 作為 X.brevicollum的同物異名.因此該蟲(chóng)初步判斷為短頸劍線蟲(chóng) X.brevicollum Lordello et Da Costa，1961.

表1 短頸劍線蟲(chóng)日本種群與模式標(biāo)本的形態(tài)測(cè)量值Tab.1 Morphometrics of Xiphinema brevicollum popuLations from Japan and paratypes

2.2 喜馬拉雅劍線蟲(chóng)形態(tài)鑒定

雌蟲(chóng):熱殺死后蟲(chóng)體呈“C”形.頭部連續(xù)，側(cè)器囊倒馬鐙形.齒尖針細(xì)長(zhǎng)、針狀、高度硬化，齒尖針基部呈叉狀，齒托基部呈顯著的凸緣狀;齒針導(dǎo)環(huán)為雙環(huán)，后環(huán)高度骨化，導(dǎo)環(huán)位于齒尖針后部靠近齒尖針與齒托相連接處.陰門(mén)位于蟲(chóng)體中部稍后，陰門(mén)橫裂.雙生殖腺、對(duì)生、等長(zhǎng);卵巢回折覆蓋整個(gè)輸卵管部分，內(nèi)部充滿細(xì)菌.尾短圓錐形，背面彎曲、腹面直或略彎，尾端圓，尾長(zhǎng)等于或略短于肛門(mén)處體寬(圖1D～1F).

雄蟲(chóng):未見(jiàn).

幼蟲(chóng):熱殺死后蟲(chóng)體成“J”形.根據(jù)蟲(chóng)體長(zhǎng)度、齒針長(zhǎng)度及替代齒針長(zhǎng)度，劃分4個(gè)齡期，隨著齡期增長(zhǎng)身體彎曲程度加大，尾變短，c'變小.

喜馬拉雅劍線蟲(chóng)形態(tài)測(cè)量值見(jiàn)表2.根據(jù)Lamberti等［10］檢索表，從日本羅漢松根際截獲的劍線蟲(chóng)測(cè)量特征代碼為 A5、B2、C1、D2/3、E3、F1、G1、H2、I2.除了D值偏小外，其他特征代碼都符合Xiphinema himalayense Ahmad，Lamberti，Rawat，Agostinelli et Srivastava，1998代碼.

表2 喜馬拉雅劍線蟲(chóng)日本種群與Xiphinema himalayense模式標(biāo)本的形態(tài)測(cè)量值Tab.2 Morphometrics of Xiphinema himalayense popuLations from Japan and paratype from India

該線蟲(chóng)的鑒定特征及測(cè)量值與Ahmad等［4］對(duì)X.himalayense的描述基本相符，只是蟲(chóng)體偏短，但差異不大.因此初步判斷該蟲(chóng)為喜馬拉雅劍線蟲(chóng)X.himalayense Ahmad，Lamberti，Rawat，Agostinelli et Srivastava，1998.

2.3 分子生物學(xué)特征

2.3.1 ITS區(qū)分子生物學(xué)特征 ①短頸劍線蟲(chóng)ITS區(qū)分子生物學(xué)特征:短頸劍線蟲(chóng)的ITS區(qū)擴(kuò)增1 448 bp的片段(GenBank登錄序列號(hào):HQ184474).通過(guò)Clustal W進(jìn)行BLAST比對(duì)，HQ184474與GenBank上注冊(cè)的序列 AY359858(X.diffusum)、AY430181(X. brevicollum)、AY580057(X. brevicollum)、AY430190(X.brevicollum)相似性99.2%以上.在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) (圖 2)中 HQ184474與 AY359858、AY430181、AY580057、AY430190 位于同一分支，親緣關(guān)系很近.比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析證實(shí)Luc等［9］的觀點(diǎn)，即X.diffusum為 X.brevicollum的同物異名，同時(shí)進(jìn)一步確認(rèn)該蟲(chóng)為短頸劍線蟲(chóng)X.brevicollum.

②喜馬拉雅劍線蟲(chóng) ITS區(qū)分子生物學(xué)特征:喜馬拉雅劍線蟲(chóng)的ITS區(qū)擴(kuò)增1 390 bp的片段(Gen-Bank登錄序列號(hào):JN091971)，通過(guò)Clustal W進(jìn)行BLAST比對(duì)，JN091971與 X.brevicollum相似性較低，低于97.3%.在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)中，JN091971與X.brevicollum、X.incognitum親緣關(guān)系較近，與Ahmad等［4］描述的近似種吻合.

圖2 基于ITS序列的美洲劍線蟲(chóng)ME系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogeny of the Xiphinema americanum group inferred from ME analysis of ITS expansion regions

2.3.2 D2D3區(qū)分子生物學(xué)特征 ①短頸劍線蟲(chóng)D2D3區(qū)分子生物學(xué)特征:短頸劍線蟲(chóng)D2D3區(qū)擴(kuò)增833 bp的片段(GenBank登錄序列號(hào):HQ184473).在NCBI上進(jìn)行 BLAST比對(duì)，與 AY601604(X.brevicollum)、HM163209(X.brevicollum)相似性99.9%以上.在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)中HQ184473與AY601604(X.brevicollum)位于同一分支，親緣關(guān)系很近.從比對(duì)和進(jìn)化分析結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)該蟲(chóng)為短頸劍線蟲(chóng)X.brevicollum.

圖3 基于D2D3序列的美洲劍線蟲(chóng)ME系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogeny of the Xiphinema americanum group inferred from ME analysis of D2D3 expansion regions

②喜馬拉雅劍線蟲(chóng)D2D3區(qū)分子生物學(xué)特征:喜馬拉雅劍線蟲(chóng)D2D3區(qū)擴(kuò)增831 bp的片段(GenBank登錄序列號(hào):JN091972).在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)中，與X.brevicollum、X.taylori親緣關(guān)系較近，與 Ahmad等［4］描述的近似種吻合.

3 討論

短頸劍線蟲(chóng)和喜馬拉雅劍線蟲(chóng)都屬于美洲劍線蟲(chóng)組Xiphinema americanum group，由于美洲劍線蟲(chóng)組內(nèi)部分種間的差異非常小，甚至交叉重疊，rDNA序列的相似性很高，美洲劍線蟲(chóng)組的有效種數(shù)量存在爭(zhēng)議，如Lamberti等［10］認(rèn)為有49個(gè)有效種，Luc等［9］認(rèn)為有34個(gè)有效種.本文對(duì) X.diffusum 和 X.brevicollum線蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)比較及rDNA序列分析，兩者形態(tài)特征及測(cè)量值重疊，在ITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中兩者處于同一分支，說(shuō)明這2種線蟲(chóng)屬于同一種線蟲(chóng)，與 Luc等［9］認(rèn)為 X.diffusum 是 X.brevicollum 的同物異名結(jié)論吻合.

基于rDNA-ITS、D2D3序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，與 Lazarova等［11］基于 rDNA-18S和 mtDNA序列、Lamberti等［12］基于形態(tài)特征建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本類似.基于rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)不僅從一定水平上揭示了劍線蟲(chóng)屬內(nèi)種群間的親緣關(guān)系，也從另外一個(gè)角度支持了目前的形態(tài)分類觀點(diǎn)，rDNA序列可以作為劍線蟲(chóng)種類鑒定和進(jìn)化分析的良好指標(biāo).

短頸劍線蟲(chóng)于2011年在日本報(bào)道［13］.本文首次報(bào)道了喜馬拉雅劍線蟲(chóng)在日本分布，并公布了這2種線蟲(chóng)ITS、D2D3序列.

短頸劍線蟲(chóng)和喜馬拉雅劍線蟲(chóng)為國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局首次截獲.目前短頸劍線蟲(chóng)只在我國(guó)的江蘇、浙江、湖南、廣西等省區(qū)局部分布［14］.喜馬拉雅劍線蟲(chóng)在我國(guó)沒(méi)有分布記載.所以，應(yīng)加強(qiáng)進(jìn)境植物的審批和監(jiān)管，以保護(hù)我國(guó)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的安全.

致謝:短頸劍線蟲(chóng)標(biāo)本經(jīng)浙江大學(xué)鄭經(jīng)武教授的復(fù)核，在此深表謝意!

［1］KRUGER J C，HEYNS J.A study of Xiphinema brevicolle sensu Heyns，1974(Nematoda)［J］.Phytophylactic，1986，18:209-215.

［2］FRITZSCHE R，KEGLER H.Nematoden als vektoren von virus-krankheiten der obstgewachse［J］.TagBer dt Akad Lander Wiss Berl，1968，97:289-295.

［3］TRUDGILL D L，BROWN D J F，MCNAMARA D G.Methods and criteria for assessing the transmission of plant viruses by Longidorid nematodes［J］.Revue Nematol，1983，6:133-144.

［4］AHMAD M，LAMBERTI F，RAWAT V S，et al.Two new species within the Xiphinema americanum group(Nematoda，Dorylaimida)from Garhwal Himalayas，India［J］.Nematol Medit，1998，26:131-138.

［5］BRODIE B B.Potato［M］∥BARKER K R，PEDERSON G A，WINDHAM G L.Plant and nematoche interactions.Wisconsin:American of Agronomy，1998:567-594.

［6］VAIN T C.Restriction fragment length polymorphism separates species of the Xiphinema americanum group［J］.Journal of Nematology，1993，25(3):361-364.

［7］SUBBOTIN S A，STURHAN D，CHIZHOV V N，et al.Phylogenetic analysis of Tylenchida Thorne，1949 as inferred from D2 and D3 expansion fragments of the 28S rRNA gene sequences［J］.Nematology，2006，8:455-474.

［8］LAMBERTI F，BLEVE-ZACHEO T.Studies on Xiphinema americanum sensu lato with description of fifteen new species(Nematoda，Longidoridae)［J］.Nematol Medit，1979，7:51-106.

［9］LUC M，COOMANS A，LOOF P A A.The Xiphinema amerianum group(Nematoda:Longidoridae):Ⅱ:Observation on Xiphinema brevicollum Lorfello da Costa，1961 and comments on the group［J］.Fundam Appl Nematol，1998，21:475-490.

［10］LAMBERTI F，HOCKLAND S，AGOSTINELLI A，et al.The Xiphinema americanum group:Ⅲ:Keys to species identification［J］.Nematol Medit，2004，32:53-56.

［11］LAZAROVA S S，MALLOCH G，OLIVEIRA C M G，et al.Ribosomal and mitochondrial DNA analyses of Xiphinema americanum group populations［J］.Journal of Nematology，2006，38(4):404-410.

［12］LAMBERTI F，MOLINARI S，MOEN M，et al.The Xiphinema americanum group:Ⅱ:Morphometric relationships［J］.Russian Journal of Nematology，2002，10(2):99-112.

［13］SAKAI H，TAKEDA A，MIZUKUBO T.First report of Xiphinema brevicolle Lordello et Costa，1961(Nematoda，Longidoridae)in Japan［J］.Zookeys，2011，135:21-40.

［14］徐建華，傅鵬，程瑚瑞.中國(guó)七省(區(qū))劍屬線蟲(chóng)的分類學(xué)研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，18(1):37-42.