楊梯豐，張少紅，王曉飛，黃章慧，趙均良，張桂權(quán)，劉 斌

(1廣東省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所，廣東省水稻育種新技術(shù)重點實驗室，廣東廣州510640;2華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣東省植物分子育種重點實驗室，廣東廣州510642)

水稻的抽穗開花期是高溫最敏感的時期［1］.我國長江流域雙季早稻灌漿結(jié)實或中稻抽穗揚花期正值盛夏，經(jīng)常出現(xiàn)高溫天氣，嚴重影響水稻生產(chǎn).全球溫室效應日益加劇，使水稻生產(chǎn)面臨高溫挑戰(zhàn)［2］.因此，研究和解決水稻耐熱性的問題十分緊迫，對確保我國乃至世界糧食安全意義重大.利用品種的耐熱性開展水稻耐熱性育種是解決水稻高溫熱害最經(jīng)濟、有效的辦法.然而，綜觀國內(nèi)外研究表明，水稻耐熱性育種進展緩慢.其主要原因之一是鑒定出的真正有育種應用價值的耐熱水稻種質(zhì)資源還很少［3］.另一方面，水稻耐熱性是一個多基因控制的復雜性狀［4］，應用常規(guī)遺傳育種技術(shù)難以進行有效的育種.只有廣泛開展水稻優(yōu)異耐熱種質(zhì)資源的篩選鑒定和深入開展水稻耐熱性分子遺傳基礎研究，水稻耐熱性育種才能取得突破.本研究以來自11個國家的稻種資源為材料，進行抽穗開花期耐熱性鑒定，并分析耐熱性與秈粳性的關系，以期鑒定出優(yōu)異的耐熱種質(zhì)資源，為水稻耐熱性種質(zhì)資源的挖掘提供科學依據(jù)，并為下一步水稻耐熱相關基因的鑒定和育種奠定材料基礎.

1 材料與方法

1.1 供試材料

來自11個國家的水稻品種(系)共28份，進行抽穗開花期的耐熱性鑒定(表1).水稻品種“9311”和“日本晴”分別作為秈稻和粳稻的參比品種用于供試品種(系)的秈粳性分析.

表1 供試品種(系)的起源及亞種類型Tab.1 The origin and subspecies of the tested varieties(lines)

1.2 耐熱性評價

測試品種(系)單株種植于直徑11.0 cm、高23.0 cm的小圓桶，每品種(系)分對照和高溫處理2組，每品種(系)每組8株.測試品種(系)置于網(wǎng)室生長，常規(guī)水肥和病蟲害管理.在植株生長過程中保留主穗和1個最大的分蘗穗.在始穗時，對照組和高溫處理組分別置于加拿大制造的CONVIRON-PGV36型人工氣候箱進行處理.對照組的溫度設定:白天28.0℃、晚上22.0℃;高溫處理組的日平均溫度為33.5℃，具體溫度參數(shù)見圖1.處理和對照的濕度和光照條件相同，相對濕度為75% ±10%，光照度為16 000 lx.7 d后將處理過的材料搬回網(wǎng)室生長.成熟后，各品種(系)每組各取較一致的10穗測定其結(jié)實率.以耐熱指數(shù)衡量品種(系)的耐熱性，耐熱指數(shù)=高溫處理的結(jié)實率/對照的結(jié)實率.

圖1 人工氣候箱高溫處理的溫度日變化Fig.1 Daily change of temperature in the high temperature phytotron

1.3 秈粳性檢測

微量抽提DNA，選取24個對秈粳性有專一性的SSR和InDel標記(表2)進行測試品種(系)的秈粳性分析［5-6］.PCR擴增后，產(chǎn)物以60 g/L的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)Goldview染色后用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)檢測帶型.與秈稻“93-11”相同帶型記為秈性帶型，與粳稻“日本晴”相同帶型記為粳性帶型.以秈性度對測試品種(系)的秈粳性進行量化，秈性度=秈性帶型標記數(shù)/標記總數(shù).

表2 用于分析測試品種(系)秈粳性的SSR和InDel標記Tab.2 SSR and InDel markers used for analysis of indicajaponica differentiation

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 13.0軟件的Independent-samples t-test和Pearson相關系數(shù)進行差異顯著性檢測和相關分析.利用NTSYS-pc Version 2.1e進行測試品種(系)秈粳聚類分析.把每個標記的秈粳特異帶型轉(zhuǎn)化為二進制數(shù)據(jù)(1為有帶，0為無帶).先通過SIMQUAL程序，利用SM系數(shù)計算相似性矩陣，再通過SHAN程序，根據(jù)UPGMA方法進行聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 測試品種(系)耐熱性

28份品種(系)高溫處理后其結(jié)實率的變異范圍為0.6% ～58.7%，耐熱指數(shù)的變異范圍為0.01～0.85.除來自中國江西的秈稻“贛香糯”和來自印度的秈稻“N22”，其余品種(系)高溫處理后其結(jié)實率均大幅度下降，與對照的結(jié)實率差異達極顯著水平(P＜0.01).雖然“贛香糯”和“N22”高溫處理后的結(jié)實率分別為55.8%和58.7%，與其對照結(jié)實率66.4% 和68.7% 相比差異顯著(P＜0.05)，但其耐熱指數(shù)明顯高于其他品種(系)，分別為0.84和0.85，其他品種(系)的耐熱指數(shù)均少于0.50(表3).

2.2 秈粳性與耐熱性的關系

28份品種(系)的秈性度有較大差異，其變異范圍為0.21～0.83(圖2).對秈性度與其耐熱指數(shù)的相關性分析表明，耐熱性與秈性度呈顯著正相關(r=0.42，P=0.03)(圖2).秈型組和粳型組平均耐熱指數(shù)分別為0.32和0.14，秈型組顯著高于粳型組(t=2.37，P=0.03).以24個秈粳專一性標記對測試材料進行聚類，聚類結(jié)果顯示，測試品種(系)可明顯分為2組，一組有17個品種(系)，另一組有11個品種(系)(圖3)，分組結(jié)果與它們已知的秈粳亞種類型吻合(表1).

表3 高溫處理下測試品種(系)的結(jié)實率及耐熱指數(shù)Tab.3 Percentage of spikelet fertility and heat tolerance index of the tested varieties(lines)under high temperature conditions

圖2 28個品種(系)的秈性度與耐熱指數(shù)的相關性Fig.2 The correlation between degree of indica-type and heat tolerance index in the 28 varieties(lines)

圖3 根據(jù)24個秈粳特異性標記基因型對28個品種(系)的聚類Fig.3 Clustering of the 28 varieties(lines)based on the genotypes determined by the 24 indica-japonica specific markers

3 討論

本研究結(jié)果表明，盡管抽穗開花期高溫處理后水稻的結(jié)實率都明顯下降，但是水稻品種對高溫的響應有很大的差異.高溫處理后，測試的28個品種(系)的結(jié)實率最高的可達58.7%，最低的僅有0.6%;耐熱指數(shù)最高的可達0.85，最低的僅為0.01.可見，通過對稻種資源的耐熱性評價可以獲得具有強耐熱性的材料.本研究中秈稻“N22”和“贛香糯”高溫處理后仍保持較高的結(jié)實率，具有突出的耐熱性.因此，這2個品種是開展水稻耐熱性分子遺傳研究和育種的良好材料.

盡管在秈稻和粳稻中均有鑒定出耐熱的品種［7-8］，但是對不同生態(tài)型水稻抽穗開花期的耐熱性鑒定結(jié)果表明，秈稻的耐熱性比粳稻的強［9］.然而，以往的研究是根據(jù)形態(tài)指數(shù)法對品種的秈粳性進行劃分，考察其秈粳性與耐熱性的關系.應用形態(tài)指數(shù)法進行秈粳性分類有一定的主觀性，并受環(huán)境條件影響，而且這種分類方法無法對水稻品種的秈粳性進行定量分析.為了深入了解水稻秈粳分化與耐熱性的關系，本研究利用對秈粳性有專一分辨能力的SSR和InDel標記進行秈粳性分析，以秈性度對這些品種(系)的秈粳性進行量化.這種方法能客觀地反映測試水稻品種秈粳性的差異.研究結(jié)果表明，耐熱性與秈性度呈顯著正相關(P＜0.05).進一步比較秈型組和粳型組的平均耐熱指數(shù)(t-檢驗)結(jié)果表明，秈型組的平均耐熱指數(shù)(0.32)顯著高于粳型組的平均耐熱指數(shù)(0.14)(P＜0.05).因此，在秈稻資源中進行耐熱性篩選將有更大的機會獲得強耐熱性的稻種資源.

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