羅振華，王 和

(貴陽醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴陽550004)

近年來，隨免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、抗菌藥物的廣泛應(yīng)用與濫用、器官移植手術(shù)以及介入性診療操作等的普及，真菌感染尤其是機(jī)會性深部真菌感染率逐年上升［1，2］。文獻(xiàn)［3，4］報(bào)道，白假絲酵母菌等念珠菌是條件致病性真菌感染的主要病原體，占目前醫(yī)院內(nèi)真菌感染率的首位。臨床對于致病性真菌的鑒定主要依賴形態(tài)、培養(yǎng)和生化反應(yīng)，近年來國內(nèi)外已開始研究和采用基因檢測與分析的方法進(jìn)行真菌研究、鑒定與分類［5～7］。為了解貴州地區(qū)致病性念珠菌的基因類型、分布情況和藥物敏感性特點(diǎn)，2007年1月～2010年12月，我們對臨床標(biāo)本分離的343株念珠菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)、25SrDNAⅠ型內(nèi)含子序列和藥物敏感性進(jìn)行了檢測與分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及其分布 按文獻(xiàn)［8］方法從317例(貴陽市、安順市、凱里市、興義市的二級或三級醫(yī)院)感染患者的標(biāo)本中分離致病性念珠菌343株，其中分離自痰或或纖支鏡標(biāo)本分離227株(66.1%)、陰道分泌物 58 株(16.9%)、尿液 38 株(11.0%)、糞便5 株(1.5%)、精液5 株(1.5%)、前列腺液 5株(1.5%)、傷口分泌物 3株(0.9%)、血液1 株(0.3%)、胸水1 株(0.3%)。

1.2 念珠菌基因檢測與鑒定 ①DNA提取:用Fungus DNA extraction isoplant試劑盒(日本和光純藥工業(yè))及其方法處理和分離提取念珠菌的DNA。②ITS序列檢測與分析:用引物ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'和ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(美國 AmershamBiosciences公司)擴(kuò)增各分離菌株的ITS序列［9］。PCR反應(yīng)體系總體積為 25μL，含 puReTaq Ready-To-Go PCR beads(美國 AmershamBiosciences公司)1份、引物ITS5和ITS4各1μL、DNA模板液1μL、蒸餾水補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳50 V電泳1 h，260 nm紫外線燈下觀察和送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司做序列測定。測序結(jié)果用CLC sequence Analysis軟件分析，經(jīng)BLAST檢索搜索GeneBank及DDBJ數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列的同源性分析，根據(jù)99%以上符合率鑒定菌種。③25SrDNA I型內(nèi)含子序列檢測:分別對ITS鑒定的白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌及熱帶假絲酵母菌進(jìn)行25SrDNA I型內(nèi)含子序列檢測，用引物CA-INT-L 5'-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-3'和CA-INT-R 5'-CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3'(美國 AmershamBio-sciences公司)擴(kuò)增其25S rDNAⅠ型內(nèi)含子區(qū)［6］。PCR反應(yīng)總體積為25μL，含PCR bead 1份、引物CA-INT-L和 CA-INT-R各 2.5μL、DNA模板液 1 μL、蒸餾水補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min、65℃退火1 min、72℃延伸2.5 min共30個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳50 V電泳1 h，260 nm紫外線燈下觀察，對照25S rDNAⅠ型內(nèi)含子基因型陽性菌株［日本千葉大學(xué)病原性真菌與真菌毒素研究所惠贈，包括白假絲酵母菌54366(基因 A型)、54368(基因 B型)、54375(基因 C型)、49826(基因E型)，都柏林假絲酵母菌54605(基因D型)］的電泳圖譜鑒定分離菌株的基因型。白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌部分菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司做序列測定，結(jié)果用CLC sequence Analysis軟件分析，經(jīng)BLAST檢索GeneBank及DDBJ數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列的同源性分析及比對分析基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.3 藥物敏感試驗(yàn) 按ATB FUNGUS3酵母菌樣藥敏檢測試劑(法國梅里埃公司)說明書對227株臨床分離念珠菌進(jìn)行5-氟胞嘧啶(5-FC)、兩性霉素B(AMB)、氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VRC)的藥敏性檢測。以白假絲酵母菌ATCC 10231和克柔假絲酵母菌ATCC6258為質(zhì)控菌株(中國生物藥品檢定所提供)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，率的比較行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 念珠菌的ITS類型 分離的343株念珠菌經(jīng)ITS序列分析，分別為白假絲酵母菌210株(61.2%)、光滑假絲酵母菌 45 株(13.1%)、熱帶假絲酵母菌29株(8.4%)，見表1。

2.2 25S rDNAⅠ型內(nèi)含子基因型 ①25S rDNAⅠ型內(nèi)含子電泳圖譜:210株白假絲酵母菌Ⅰ型內(nèi)含子基因型分別為A型115株(54.8%)、B型58株(27.6%)、C 型37株(17.6%)，未發(fā)現(xiàn)D 型與 E 型菌株，見圖1。29株光滑假絲酵母菌和17株熱帶假絲酵母菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為約450 bp的單一條帶，見圖2、3。②25SrDNAⅠ型內(nèi)含子序列:光滑假絲酵母菌與熱帶假絲酵母菌25S rDNAⅠ型內(nèi)含子測序全長 461 bp，GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的核苷酸數(shù)據(jù)庫基因序列對比與白假絲酵母菌編碼25S rRNA基因(登錄號AY441784)序列同源性達(dá)99%。光滑假絲酵母菌與熱帶假絲酵母菌25S rDNAⅠ型內(nèi)含子與白假絲酵母菌54366(基因A型)25SrDNAⅠ型內(nèi)含子序列的同源性分別為90%和97%。

表1 343株臨床分離念珠菌ITS鑒定結(jié)果

圖1 白假絲酵母菌25S r DNAⅠ型內(nèi)含子序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 光滑假絲酵母菌25Sr DNAⅠ型內(nèi)含子序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果注:1為DNA Marker;2～13為光滑假絲酵母菌臨床分離株

圖3 熱帶假絲酵母菌25Sr DNAⅠ型內(nèi)含子序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果注:1為DNA Marker;2～13為熱帶假絲酵母菌臨床分離株

2.3 不同類型菌株的藥物敏感性 227株念珠菌對5-FC和AMB具有較高的藥物敏感率，其中白假絲酵母菌5-FC與AMB的藥物敏感率分別為91.5%和98.9%。白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌對唑類藥物的敏感率較低(33.3% ～82.9%)，其中白假絲酵母菌對唑類藥物的耐藥率達(dá)82.9%(見表2)。

表2 227株念珠菌的藥物敏感率(%)

2.4 白假絲酵母菌不同基因型的藥物敏感性 97株白假絲酵母菌基因A型、51株基因B型和28株基因C型對5-FC和AMB具有較高的敏感率(88.7% ～100.0%)，對唑類藥物具有較高的耐藥率(72.5% ～89.3%)，見表3。各基因型間的藥物敏感性無顯著性差異(P＞0.05)。

表3 白假絲酵母菌A、B和C基因型的藥物敏感性

3 討論

近年來，念珠菌已成為深部真菌感染中最常見的條件致病性真菌，常繼發(fā)于細(xì)菌或病毒感染、腫瘤、機(jī)體免疫力低下、插管等侵入性操作以及抗菌藥物的不規(guī)范使用等情況下［1，5，10］。本文結(jié)果顯示，自臨床標(biāo)本分離的343株致病性念珠菌中，白假絲酵母菌占檢出率的首位(61.2%);其次分別是光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌等。提示白假絲酵母菌是本地區(qū)念珠菌感染的常見病原性真菌，與國內(nèi)外報(bào)道［10，11］相似。文獻(xiàn)［5，12，13］報(bào)道，ITS是位于真菌染色體上18S rDNA和5.8S rDNA之間及5.8SrDNA和28S rDNA之間的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列，相同菌種的ITS區(qū)序列具有大于99%的相似性，因此近年來國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于真菌的基因鑒定及其流行病學(xué)調(diào)查與研究。本文結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，采用ITS序列PCR擴(kuò)增及序列分析的方法，有助于提高致病性念珠菌鑒定的敏感性與特異性。

白假絲酵母菌的25S rDNA編碼區(qū)內(nèi)存在可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子核苷酸序列，根據(jù)內(nèi)含子缺失以及形成的片段大小，可將白假絲酵母菌劃分為A、B、C、D和E五種基因型，其中基因A型缺乏Ⅰ型內(nèi)含子。白假絲酵母菌的不同基因型在引起感染的分布、抗真菌藥物敏感性等方面存在差異［6］。本文結(jié)果顯示，貴州地區(qū)深部感染致病性白假絲酵母菌的基因包括A型、B型和C型，未檢出D型和E型，其中A型檢出率最高(54.8%)，與國內(nèi)外文獻(xiàn)［6，14］報(bào)道相似。提示基因A型、B型和C型為貴州地區(qū)深部感染患者的病原性白假絲酵母菌常見基因型，尤以A型為著。熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌25S rDNAⅠ型內(nèi)含子序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與白假絲酵母菌基因A型擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致(約450 bp)，經(jīng)序列比對與白假絲酵母菌基因A型相似率分別為97%和90%。提示光滑假絲酵母菌與熱帶假絲酵母菌25SrDNA序列中不存在可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子，采用PCR擴(kuò)增25SrDNAⅠ型內(nèi)含子方法對白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型具有較高的特異性。

致病性真菌耐藥性菌株的形成與擴(kuò)散對臨床治療真菌感染的效果產(chǎn)生了重要的不利影響。本文結(jié)果顯示，臨床分離念珠菌對5-FC和AMB的敏感率較高，其中白假絲酵母菌的敏感率分別高達(dá)91.5%和98.9%。但其中常見的致病性菌種白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌對唑類藥物均具有較高的耐藥率(33.3% ～82.9%)，尤其白假絲酵母菌的唑類藥物耐藥率達(dá)82.9%。提示本地區(qū)常見致病性念珠菌存在較高對唑類藥物耐藥率及交叉耐藥現(xiàn)象，可能與這些抗真菌藥物的廣泛使用或不規(guī)范使用有關(guān)。文獻(xiàn)［14，15］報(bào)道，白假絲酵母菌的不同基因型具有不同的抗真菌藥物敏感性。本文結(jié)果顯示，白假絲酵母菌基因A型、B型和C型菌株對5-FC和AMB均具有較高的敏感率(88.7% ～100.0%)，但對唑類藥物具有較高的耐藥率(72.5% ～89.3%)，其中基因A型對5FC的耐藥率(11.3%)高于基因 B型(7.8%)與基因 C型(0)，與文獻(xiàn)報(bào)道［14，15］相似。

本地區(qū)臨床分離的致病性念珠菌以白假絲酵母菌及其基因A型最常見，檢測ITS序列和25S rDNAⅠ型內(nèi)含子序列有助于致病性念珠菌的快速鑒定;白假絲酵母菌對唑類藥物的高耐藥性以及交叉耐藥性是造成真菌感染患者臨床治療困難的一個(gè)重要因素。

［1］馮文莉，楊靜，奚志琴，等.3年間醫(yī)院內(nèi)侵襲性真菌感染的病原菌分布及臨床分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18(7):1030-1033.

［2］Chapman SW，Sullivan DC，Cleary JD.In search of the holy grail of antifungal therapy［J］.Trans Am Clin Climatol Assoc，2008，119:197-216.

［3］Miceli MH，Diaz JA，Lee SA.Emerging opportunistic yeast infection［J］.Lancet Infect Dis，2011，11(2):142-151.

［4］Machado AG，Komiyama EY，Santos SSF，et al.In vitro adherence of Candida albicans isolated from patients with chronic periodontitis［J］.JAppl Oral Sci，2011，19(4):1678-1682.

［5］李勁松，宋詩鐸，祁偉，等.常見深部念珠菌感染快速基因診斷［J］.中國感染控制雜志，2004，3(3):198-201.

［6］Tamura M，Watanabe K，Mikami Y，et al.Molecular characterization of new clinical isolates of candida albicans and C.dubliniensis in Japan:analysis reveals a new genotype of C.albicans with group I intron［J］.JClin Microbiol，2001，39(12):4309-4315.

［7］Tay ST，Chai HC，Na SL，et al.Molecular subtyping of clinical isolates of Candida albicans and identication of Candidadubliniensis in Malaysia［J］.Mycopathologia，2005，159(3):325-329.

［8］葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜，等.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］.南京:東南大學(xué)出版社，2006:736-753.

［9］White TJ，Bruns T，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［A］.In:Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ，et al∥PCR protocols，a guide to methods and applications［C］.Academic Press，San Diego，Calif，1990:315-322.

［10］Morace G，Borghi E.Fugal infections in ICU patients:epidemiology and the role of diagnostics［J］.Minerva Anestesiologica，2010，76(11):950-956.

［11］袁春雷，李介華，李冬秀，等.323株酵母樣真菌的分離鑒定與耐藥性分析［J］.中國公共衛(wèi)生雜志，2004，20(1):98.

［12］Chang HC，Leaw SN，Huang AH，et al.Rapid identification of yeasts in positive blood cultures by a multiplex PCR method［J］.J Clin Microbiol，2001，39(10):3466-3471.

［13］Leaw SN，Hsien CC，Hsiao FS，et al.Identi cation of Medically Important Yeast Species by Sequence Analysis of the Internal Transcribed Spacer Regions［J］.JMicrobiol，2006，44(3):693-699.

［14］朱曉芳，章強(qiáng)強(qiáng)，藍(lán)和魁，等.白念珠菌臨床分離株的基因分型及藥物敏感性研究［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2004，25(4):82-84.

［15］Mc Cullough M，Clemons KV，Stevens DA.Molecular and phenotypic characterization of genotypic Candida albicans subgroups and comparison with Candida dubliniensis and Candida stellatoidea［J］.JClin Microbio，1999，37(2):417-421.