耿 倩，馬 倩，鄒玉安，薛 茜

(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000;2河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

在中國(guó)，腦卒中是僅次于癌癥的第2位殺手，是威脅中老年人生命健康的常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中缺血性腦血管病(ICVD)占56.6% ～80%，患者總?cè)藬?shù)達(dá)500萬(wàn) ～600萬(wàn)，存活者致殘率最高達(dá)約75%［1］。ICVD的防治已成為目前研究重點(diǎn)。2011年4月，我們觀察了康腦液對(duì)腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)增殖的影響，旨在為康腦液防治ICVD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量200～270 g，SPF/UAF級(jí)，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部［許可證號(hào)SCXK(京)2006-0008］。②藥品及試劑:康腦液飲片(河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院)，冷水浸泡一夜，煎煮2次，濾出藥渣，將2次煎煮的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%康腦液(每毫升分別含生藥4、2、1 g)，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，南京探求生物技術(shù)有限公司)粉劑(按10 mg/mL溶解于生理鹽水中)，兔抗鼠巢蛋白(Nestin)抗體(鎮(zhèn)江厚普生物科技公司)，鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體(北京中山生物技術(shù)公司)。③實(shí)驗(yàn)儀器:電腦生物組織包埋機(jī)(浙江金華科迪儀器公司)，石蠟切片機(jī)(美國(guó)Thermo)，電腦生物組織攤片烤片機(jī)(浙江金華科迪儀器公司)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS BX60型)，顯微攝影裝置(日本 NIKON)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將120只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及康腦液高、中、低劑量組，每組24只。五組均于術(shù)前7 d開(kāi)始灌胃，其中康腦液高、中、低劑量組分別予24、12、6 g/(kg·d)康腦液，假手術(shù)組及模型組給予等量蒸餾水，1次/d、直至處死。模型組及康腦液各組均根據(jù)Longa等研究，以線栓經(jīng)右側(cè)頸外動(dòng)脈插線法建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，假手術(shù)組僅切開(kāi)動(dòng)脈、不阻斷。術(shù)后24 h五組均開(kāi)始腹腔注射BrdU溶液50 mg/kg，1次/d、直至處死。

1.3 腦組織取材及BrdU、Nestin表達(dá)檢測(cè) ①腦組織取材:分別于缺血2 h再灌注后3、7、14、21 d各取6只處死取材:腹腔注射10%水合氯醛麻醉，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，灌注肝素化生理鹽水300 mL，4%多聚甲醛灌注固定30 min，快速斷頭取腦，以視交叉為中線將腦組織切成厚度2～3 mm的組織塊，4%多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟切片，切片厚度為3μm。②BrdU、Nestin表達(dá)檢測(cè):采用免疫組化SP法。按照說(shuō)明書(shū)操作，80℃烤片120 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min;微波中火，0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH值為6.0)修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫;3%H2O2室溫孵育10 min;正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育15 min，傾去、勿洗;滴加一抗(工作濃度為 1∶100)、4℃過(guò)夜，滴加生物素化二抗、37℃孵育15 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液、37℃孵育15 min;DAB顯色，顯微鏡觀察染色結(jié)果，以細(xì)胞呈棕黃色為陽(yáng)性信號(hào)。每只大鼠取相同部位的切片各3張，每張切片在鏡下(×400)隨機(jī)選取缺血側(cè)5個(gè)非重疊視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均值(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/400倍視野)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組內(nèi)比較用方差分析，組間比較行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

假手術(shù)組大腦皮質(zhì)、海馬部位有少量 BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞;余四組再灌注7 d時(shí)BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始增多，14 d達(dá)高峰、21 d開(kāi)始下降，但各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05或0.01);與模型組比較，康腦液各組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P＜0.05或0.01)，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在再灌注后第7、14、21天均顯著升高 (P ＜0.05)，見(jiàn)表1、2 及圖1、2。

3 討論

表1 五組腦缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)Brd U陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(n=24，個(gè)，ˉx±s)

表2 五組腦缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(n=24，個(gè)，ˉx±s)

圖1 五組腦缺血再灌注后14 d缺血側(cè)皮質(zhì)Brdu表達(dá)(×400)

圖2 五組腦缺血再灌注后14 d缺血側(cè)皮質(zhì)Nestin表達(dá)(×400)

自Eriksson等發(fā)現(xiàn)成年人腦中存在神經(jīng)元發(fā)生現(xiàn)象后，成年人腦神經(jīng)元不能再生的理論即被打破。眾多研究表明，成年哺乳動(dòng)物內(nèi)源性NSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，改變內(nèi)環(huán)境能激發(fā)靜止?fàn)顟B(tài)的NSC并誘導(dǎo)其增殖、向病灶遷移，進(jìn)而定向分化為成熟神經(jīng)元以替代受損或缺失的神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)。因此，利用神經(jīng)細(xì)胞因子或藥物等增強(qiáng)腦內(nèi)源性NSC自我更替和修復(fù)能力可能是一種新的腦部疾病治療途徑，為ICVD的治療提供了新的思路。中醫(yī)認(rèn)為，腦卒中發(fā)生主要是由于氣虛血瘀所致，治療原則以益氣活血化瘀為主。目前研究發(fā)現(xiàn)，黃芪［2］、川芎［3］等單味中藥的某些成分和復(fù)方芪棱湯［4］、通心絡(luò)［5］、補(bǔ)陽(yáng)還五湯［6］等均能促進(jìn)神經(jīng)再生?？的X液為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由益氣活血的鼻祖方補(bǔ)陽(yáng)還五湯按照現(xiàn)代人的特點(diǎn)化裁而來(lái)，由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七等組成，臨床用于治療ICVD具有較好療效。

BrdU是一種胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物，NSC發(fā)生分裂增殖后可作為底物參與DNA合成，被視為細(xì)胞增殖的標(biāo)記。已有研究表明，腦缺血可促進(jìn)大腦皮質(zhì)、海馬等處 NSC 增殖、遷移和分化［7～9］，且 NSC 增殖也有一定規(guī)律性，即神經(jīng)再生并不是在腦缺血后短期內(nèi)增強(qiáng)的，其再生能力在第10天左右達(dá)到峰值［10］。Nestin是NSC內(nèi)一種特殊的中間絲蛋白，被視為其特異性標(biāo)記蛋白［11，12］，其C末端大量的絲氨酸可能是磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸的磷酸化可能影響Nestin與其他細(xì)胞骨架的結(jié)合。因此，Nestin很可能是一種自我保護(hù)性蛋白，有利于細(xì)胞存活及細(xì)胞骨架的穩(wěn)重和重建，其重新表達(dá)在缺血腦周?chē)赡茉黾幽X組織的抗缺血能力，從而有利于神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)。本研究顯示，假手術(shù)組大腦皮質(zhì)、海馬部位有少量BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞;余四組再灌注7 d時(shí)BrdU、Nestin陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始增多，14 d達(dá)高峰、21 d開(kāi)始下降，但各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于假手術(shù)組;與模型組比較，康腦液各組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在再灌注后第7、14、21 d顯著升高。提示康腦液可通過(guò)上調(diào)BrdU、Nestin表達(dá)促進(jìn)腦缺血損傷后內(nèi)源性NSC增殖，此為其治療ICVD的重要機(jī)制之一;但上調(diào)的確切機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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