李念文，周文獻(xiàn)，廖小莉，林 燕，李永強(qiáng)

(1扶綏縣人民醫(yī)院，廣西扶綏532100;2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)

據(jù)報(bào)道，腦腫瘤約占所有兒童腫瘤的20%［1］，為發(fā)病率最高的兒童實(shí)體腫瘤。膠質(zhì)瘤約占兒童腦腫瘤的10%［2］，可發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的任何位置。迄今為止，某些類型的神經(jīng)膠質(zhì)瘤(如彌漫性腦干膠質(zhì)瘤)仍然是兒童顱內(nèi)腫瘤死亡的主要原因之一［1］，該分型膠質(zhì)瘤兒童的中位生存時(shí)間不超過1 a［2］。膠質(zhì)瘤具有遺傳性疾病的特征，即同時(shí)存在基因表達(dá)缺陷與過度表達(dá)［3］。富含半胱氨酸酸性蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)已經(jīng)被證實(shí)在膠質(zhì)瘤中表達(dá)增強(qiáng)并促進(jìn)了其發(fā)展進(jìn)程［4］。2011年10月 ～2012年3月，我們通過RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SPARC表達(dá)，并觀察了后者對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷徙及黏附能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細(xì)胞及其培養(yǎng)所用材料:人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251(中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室提供)，放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng);胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，PBS及HBSS緩沖液，胰蛋白酶(美國Introvigen公司);細(xì)胞培養(yǎng)液由10%胎牛血清加入DMEM培養(yǎng)基中制備而成，每毫升培養(yǎng)液含青霉素100 U及鏈霉素0.1 mg;將0.25%胰蛋白酶溶于HBSS緩沖液后過濾除菌，用于細(xì)胞消化傳代。②RNA干擾試驗(yàn)相關(guān)材料:小干擾RNA(siRNA)試劑均為北京傲銳東源(OriGene)公司產(chǎn)品，包括預(yù)設(shè)計(jì)人雙鏈siRNA片段(Human-3 unique 27mer siRNA duplexes)，空白對(duì)照人雙鏈siRNA陰性對(duì)照片段(Trilencer-27 Universal Scrambled Negative Control siRNA Duplex)及溶解siRNA的去RNA酶緩沖液(RNAse free siRNA Duplex Resuspension Buffer)，RT-PCR實(shí)驗(yàn)用TRIzol與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，TaKaRa Ex Taq耐熱性DNA聚合酶及引物由上海生工生物工程公司提供。③細(xì)胞增殖、遷徙及黏附實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料:噻唑藍(lán)(MTT)為美國Sigma公司產(chǎn)品，溶于PBS緩沖液(終質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，用0.22μm濾膜過濾除菌后4℃避光保存;嵌入式細(xì)胞培養(yǎng)室 Boyden Chamber購于美國Becton Dickinson公司(直徑 6.5 mm，孔徑8 μm)，分為上室與下室，兩室底面均由明膠包被，兩室之間由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，PET)膜相隔;普通平底96孔板，戊二醛(普通分析純，溶于PBS緩沖液)，結(jié)晶紫，十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)，均購于江蘇碧云天(Beyotime)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNAi試驗(yàn) 取人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251接種于24孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)至約70%細(xì)胞覆蓋密度，吸走培養(yǎng)液，換含血清、無抗生素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至約90%覆蓋密度，換無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，12 h后分別加入預(yù)設(shè)計(jì)人雙鏈siRNA片段及對(duì)照人雙鏈siRNA陰性對(duì)照片段，至終濃度均為10 nmol/L;孵育4 h，吸走并棄去原培養(yǎng)液，換普通培養(yǎng)液;48 h后運(yùn)用RT-PCR檢測SPARC表達(dá)，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件參照Sato等［5］報(bào)道，同時(shí)擴(kuò)增磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照;運(yùn)用Quantity One4.62軟件分析凝膠電泳結(jié)果，以SPARC/GAPDH半定量評(píng)價(jià)SPARC表達(dá)改變。

1.2.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 取人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251隨機(jī)分為SPARC組及對(duì)照組，分別以SPARC-siRNA及對(duì)照siRNA處理后重懸于含血清的DMEM培養(yǎng)基中，以每孔5×103的密度接種于96孔板;24 h后吸走培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，MTT溶液染色10 min，PBS沖洗3次，分光光度計(jì)測量波長為570 nm的OD值;48、72 h分別重復(fù)以上操作，各時(shí)間點(diǎn)分別測量SPARC組及對(duì)照組各6孔OD值，繪制生長曲線。

1.2.3 細(xì)胞遷徙試驗(yàn) 參照 Yang等［6］報(bào)道的方法。同上分組、處理及重懸U251細(xì)胞，按1×105/孔密度接種于Boyden Chamber上室，下室加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液;8 h后以4%甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，小棉簽小心拭去PET膜上室面的細(xì)胞;運(yùn)用Quantity One4.62軟件計(jì)算每組6個(gè)隨機(jī)視野的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 參照Rempel等［7］報(bào)道的方法。同上分組、處理及重懸U251細(xì)胞，按5×104/孔注入96 孔培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，0.5、1、2 h 后以350 r/min水平搖床震蕩5 min，吸走培養(yǎng)液、PBS緩沖液沖洗2～3次(除去全部未貼壁細(xì)胞);1%戊二醛固定已貼壁細(xì)胞30 min，PBS沖洗后0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗，用1%SDS溶液洗脫非細(xì)胞染色的結(jié)晶紫;分光光度計(jì)測量吸收光波長為540 nm處的OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。單因素方差分析(One-way ANOVA)用于檢驗(yàn)組間增殖及黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)組間遷徙能力，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RNAi下調(diào)SPARC表達(dá)的效果 與陰性對(duì)照者比較，siRNA試劑處理后U251細(xì)胞SPARC表達(dá)約下降70%，其半定量值分別為 0.61 ±0.11、0.18±0.05(P ＜0.05);凝膠電泳圖見圖1。

圖1 siRNA處理后SPARC表達(dá)的凝膠電泳圖

2.2 SPARC-siRNA處理后細(xì)胞增殖、遷徙及黏附能力變化 ①細(xì)胞增殖:兩組細(xì)胞生長曲線見圖2，其中48、72 h時(shí)點(diǎn)SPARC組OD值顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。②細(xì)胞遷徙:SPARC組及對(duì)照組嵌于Boyden Chamber的PET下室面(即通過遷移運(yùn)動(dòng)穿越了PET膜)的細(xì)胞數(shù)分別為(357±59)、(546±86)個(gè)/視野(P ＜0.05)，見圖 3。③細(xì)胞黏附:SPARC組細(xì)胞黏附速度明顯慢于對(duì)照組(P＜0.05)，見圖4。

3 討論

圖2 SPARC組及對(duì)照組細(xì)胞生長曲線

圖3 細(xì)胞遷徙試驗(yàn)隨機(jī)視野圖

圖4 SPARC組及對(duì)照組細(xì)胞黏附能力

隨著核磁共振(MRI)等影像學(xué)方法的廣泛應(yīng)用，膠質(zhì)瘤的診斷水平得到顯著提高，但手術(shù)切除仍是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惟一有效手段，而膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間在過去20 a中并無明顯改善［1］。因此，探索手術(shù)切除之外的膠質(zhì)瘤治療新方式顯得尤為迫切。近年來，SPARC蛋白已經(jīng)引起越來越多腫瘤研究者的關(guān)注，其表達(dá)在各腫瘤中不盡相同，在胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和肺癌中表達(dá)下調(diào)或者失活，而在膠質(zhì)瘤及黑色素瘤中表達(dá)增強(qiáng)［4，8］。深入的功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SPARC參與了增殖、遷移、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等腫瘤發(fā)展進(jìn)程;在眾多人類腫瘤中，SPARC作為一個(gè)失活了的抑癌基因參與腫瘤的進(jìn)展。但在膠質(zhì)瘤中，增強(qiáng)表達(dá)的SPARC卻扮演一個(gè)促癌基因的角色。Rempel等率先報(bào)道了在細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境下，SPARC蛋白可調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、黏附及遷徙，且此調(diào)節(jié)能力與分泌型SPARC蛋白的濃度有關(guān)［7］;隨后在體研究得出與此相似的結(jié)果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SPARC可延緩膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，但卻增強(qiáng)其侵襲能力［9］，此雖可部分解釋SPARC異常高表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)的臨床現(xiàn)象［4］，卻未能完全闡述清楚SPARC在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的具體作用。

RNAi是近年興起的一項(xiàng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄抑制基因表達(dá):當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。運(yùn)用該技術(shù)便于從另一個(gè)角度(即從過表達(dá)到失活表達(dá))研究SPARC的腫瘤相關(guān)功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照者比較，siRNA試劑處理后U251細(xì)胞SPARC表達(dá)約下降70%，其半定量值分別為0.61 ±0.11、0.18 ±0.05(P ＜0.05)。提示 RNAi可顯著下調(diào)SPARC表達(dá)。本研究還顯示，與對(duì)照組比較，SPARC組U251細(xì)胞增殖明顯變慢、遷徙活動(dòng)減弱。此與以上所述運(yùn)用分子轉(zhuǎn)染技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相一致，顯示SPARC確實(shí)可正向調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的增殖與遷徙活動(dòng)。Seno等［10］研究亦認(rèn)為，下調(diào)SPARC表達(dá)可抑制體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷徙活動(dòng)，但具體機(jī)制尚未明了。眾所周知，細(xì)胞遷徙是通過胞體形變進(jìn)行的定向移動(dòng)，而變形后的細(xì)胞一般需要重新黏附到所運(yùn)動(dòng)到達(dá)的新表面，因此黏附能力對(duì)于細(xì)胞遷徙活動(dòng)十分重要。本研究顯示，siRNA處理后的U251細(xì)胞黏附能力亦明顯減弱。提示SPARC可能通過改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞的黏附能力而調(diào)控其遷徙活動(dòng)，并進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

總之，SPARC可通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖、遷徙及黏附能力而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，有望成為一個(gè)具有腫瘤特異性的基因敲除治療靶點(diǎn)。

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