于紅麗，陳 彥，戚大石，劉 佩，劉朋飛，姚瑞芹

(1徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，江蘇徐州221002;2徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院)

腦缺血可激活靜息的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，病變部位的信號(hào)可誘導(dǎo)其向病灶區(qū)遷移并分化為區(qū)域特異性神經(jīng)細(xì)胞，與周圍神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，為腦缺血或其他神經(jīng)退行性病變后的內(nèi)源性修復(fù)提供結(jié)構(gòu)及功能保證［1～3］。但腦缺血后新生的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量很少，不足以替代損傷的神經(jīng)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)不僅可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，還對(duì)腦損傷修復(fù)起重要作用。2010年5月，我們觀察了局造性腦缺血大鼠NSCs增殖與GDNF表達(dá)的變化，旨在為腦缺血后NSCs的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠24只，體質(zhì)量(250±20)g;5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)，15%和30%的蔗糖磷酸緩沖液，10%的正常羊血清;羊抗BrdU多克隆抗體(1∶1 000，Abcam)，小鼠抗巢蛋白(Nestin)單克隆抗體(1∶1 000 ，BD PharMingen)，羊抗 BrdU 多克隆抗體(1∶1 000，Abcam)，Cy3-結(jié)合的羊抗小鼠IgG熒光二抗(1∶200)和 FITC-結(jié)合的兔抗羊IgG熒光二抗(1∶200);熒光顯微鏡。

1.2 動(dòng)物分組及大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型制備 將24只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型1組、模型2組、模型3組各6只。參照本課題組前期研究［4］建立MCAO模型，即大腦中動(dòng)脈栓塞后90 min拔出尼龍線，假手術(shù)組除尼龍線不阻塞大腦中動(dòng)脈起始部外，其他操作與模型1組相同;實(shí)驗(yàn)時(shí)室溫保持在23～25℃，相對(duì)濕度為60%。

1.3 動(dòng)物術(shù)后處理及取材、切片制備 模型1組、模型2組、模型3組及假手術(shù)組分別于術(shù)后第3、7、14和3天腹腔注射10 mg/mL的BrdU 50 mg/(kg·次)，每4 h一次，第三次注射后4 h麻醉動(dòng)物，心—升主動(dòng)脈插管灌注固定，取腦組織加入4%多聚甲醛4℃過(guò)夜，其后分別加入15%和30%的蔗糖磷酸緩沖液至組織塊沉底。作連續(xù)冷凍冠狀切片，片厚30μm。

1.4 切片染色 取上述切片分別行BrdU、Nestin、GDNF及 BrdU/Nestin免疫組織化學(xué)染色。采用ABC法，加入3%H2O2，室溫30 min;加入10%的正常羊血清，室溫30 min;加入小鼠抗Nestin單克隆抗體和GDNF抗體，4℃、72 h;加生物素結(jié)合的羊抗IgG(1∶200，Vector)，37 ℃ 2 h;加 HRP 標(biāo)記的卵白素—生物素復(fù)合物(1∶200，Vector)，37℃ 1 h;DAB/H2O2呈色(0.05%/0.01%)。除血清和一抗間之外其余各步驟間均以0.01 mol/L的PBS充分洗滌。陰性對(duì)照組除用0.01 mol/L的PBS代替一抗外，其余步驟同上。

1.5 BrdU標(biāo)記的內(nèi)源性細(xì)胞鑒定 首先將腦組織切片進(jìn)行如下處理:50%甲酰胺/2×SSC，65℃ 2 h;2 N HCL，37℃ 30 min;pH值為8.5的硼酸鹽緩沖液(B3BO3)，室溫10 min。再按上述切片染色步驟操作，一抗為羊抗BrdU多克隆抗體，免疫熒光雙標(biāo)一抗為小鼠抗nestin單克隆抗體和羊抗BrdU多克隆抗體，二抗為Cy3-結(jié)合的羊抗小鼠IgG熒光二抗(1∶200)和 FITC-結(jié)合的兔抗羊 IgG熒光二抗(1∶200);10%甘油封片，熒光顯微鏡觀察拍照，每只大鼠隨機(jī)抽5取張不同斷面的腦片，在200倍光鏡下每張腦片選3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，行ANOVA分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色 ①Nestin染色:假手術(shù)組皮層可見染色較淡的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞，胞體和突起著色，胞體很小，有2～3個(gè)纖細(xì)的突起;模型1～3組皮層Nestin陽(yáng)性細(xì)胞胞體變大，突起分支增加，呈放射狀，其中模型1、2組皮層Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著多于假手術(shù)組(P＜0.01)，見表1。②GDNF染色:假手術(shù)組皮層GDNF陽(yáng)性細(xì)胞為神經(jīng)元樣，而模型1～3組GDNF陽(yáng)性細(xì)胞為膠質(zhì)樣，其中模型2組GDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.05)，模型3組GDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組顯著降低(P ＜0.05)，見表1。

表1 四組Nestin染色和GDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(n=6，個(gè)，ˉx ±s)

2.2 BrdU標(biāo)記結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦室下層(SVZ)有2～3層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，核著色(見圖1A);模型1～3組大鼠SVZ的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞增加，其中模型2組與假手術(shù)組相比P＜0.05(見圖1B和表2)，模型3組與假手術(shù)組相似(見圖1C和表2)。假手術(shù)組大腦皮層幾乎檢測(cè)不到BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(見圖1D)，但模型1～3組大腦皮層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞均較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.01，見圖1E和表2)。Nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞幾乎均為Nestin陽(yáng)性(見圖2A～2C)。

3 討論

圖1 大鼠局灶性腦缺血后Brd U陽(yáng)性細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色情況

表2 四組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較(n=6，個(gè)，ˉx±s)

圖2 Nestin/BrdU免疫熒光雙標(biāo)染色情況

腦缺血可誘導(dǎo)成年在體NSCs的增殖和分化，使誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs治療缺血性腦損傷成為可能。研究表明，局灶性腦缺血后腦內(nèi)NSCs的增殖表現(xiàn)出時(shí)空差異。腦缺血后3 d即可見海馬BrdU標(biāo)記的NSCs的增殖，7 d時(shí)達(dá)高峰，損傷側(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞高表達(dá)一直持續(xù)到術(shù)后4周［5］;損傷側(cè) SVZ的BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞 7 d 時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)到 14 d［6，7］。另有研究報(bào)道，SVZ區(qū)細(xì)胞增殖高峰出現(xiàn)在損傷后第14 d，與對(duì)照組相比增加37%［8］。本研究顯示，模型2、3組組SVZ部位BrdU陽(yáng)性細(xì)胞均有較高表達(dá)，尤以模型2組為著;與假手術(shù)組相比，模型1、2組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且BrdU陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)為Nestin陽(yáng)性細(xì)胞。表明MCAO致腦缺血后7～14 d時(shí)NSCs細(xì)胞增殖增加，在7 d時(shí)達(dá)高峰;腦缺血后檢測(cè)到的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞是NSCs。

GDNF是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族的一個(gè)相關(guān)成員，具有廣譜性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，參與腦缺血后神經(jīng)組織的修復(fù)過(guò)程。在幾種腦缺血模型中均可見到該蛋白基因的mRNA或蛋白本身及其受體表達(dá)。在給予外源性的GDNF實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)此蛋白在腦缺血時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用，可使腦部梗塞面積減小、腦水腫程度減輕，存活神經(jīng)元數(shù)量明顯增加［9］。過(guò)表達(dá)GDNF可促進(jìn)移植NSCs的存活和分化［10，11］。本研究顯示，大鼠 MCAO 致腦缺血前后GDNF表達(dá)的細(xì)胞類型不同，假手術(shù)組SVZ的GDNF陽(yáng)性細(xì)胞為神經(jīng)元樣，而模型組GDNF陽(yáng)性細(xì)胞卻為膠質(zhì)細(xì)胞樣，模型2組GDNF陽(yáng)性細(xì)胞增加最為顯著，與NSCs細(xì)胞的增殖時(shí)間窗基本一致。表明缺血后活化的膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)增加合成、分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子而促進(jìn)NSCs的存活和增殖。

綜上所述，大鼠局灶性腦缺血后3～14 d內(nèi)源性NSCs增殖加快，GDNF表達(dá)增加可能對(duì)其起促進(jìn)作用。

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