耿昭，郭力，姚志昂，周勤梅，何成軍，熊亮

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的側(cè)生子根及加工品。被譽(yù)為亂世良將，回陽救逆之第一品，補(bǔ)先天命門真火之第一要藥[1]。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，列為下品，為攻邪要藥。臨床上一般不用生附子而用其炮制品，其炮制方法自唐代以后更加豐富起來，主要有白附片、黑順片、鹽附子等。《本經(jīng)》曰：“其味辛溫有大毒”，仲景炮附子有去皮、火炮。后世云：“古人用火炮，正是去其毒也”[3]，附子的炮制解毒[4～5]經(jīng)歷了火炮-液體輔料制-蒸制的過程，自漢代延續(xù)至今。

2010版《中國藥典》收載了附子的三種炮制品鹽附子、白附片、黑順片，生附子在2010版《中國藥典》并未收載，但在張仲景的《傷寒論》中很多處方使用了生附子而非炮制品，主要原因是當(dāng)今附子藥材種植面積較大，采收后如不經(jīng)歷膽巴水處理很容易變質(zhì)腐爛，因此本研究中我們將生附子及各炮制品一并加以對照。由于膽巴水中含有大量鈣元素，對附子不同炮制品中鈣元素含量影響很大。本研究中采用的EDTA滴定法測定附子不同炮制品中鈣元素的含量無文獻(xiàn)報道，使用常規(guī)儀器就能得出可靠結(jié)果，較其他方法更為簡便快捷，并節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

1 材料與儀器

1.1 藥材與飲片

白附片（20101001）、黑順片（20101001）購自四川佳能達(dá)攀西藥業(yè)有限公司，生附子（20101001）、鹽附子（20101001）購自江油恒源藥業(yè)集團(tuán)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室李敏教授鑒定為道地藥材。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 酸式滴定管，高溫烘箱，錐形瓶，坩堝，各種規(guī)格的容量瓶等。

1.2.2 試劑 (1) 鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取2.780g 無水氯化鈣溶于水中，然后定容至100mL，得10mg/mL鈣標(biāo)準(zhǔn)液。(2) 0.01mol/L EDTA溶液：精密稱取1.8537g EDTA于500mL容量瓶中，加水溶解后定容即得。(3)2 mol/LNaOH溶液：稱取4.00gNaOH于燒杯中，溶解冷卻后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶，定容。(4) 1 mol/LNaOH溶液：稱取2.00gNaOH于燒杯中，溶解冷卻后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶，定容。(5) 1 mol/LHCl溶液：用移液管量取5.00mL濃鹽酸于50mL容量瓶中，加水至刻度即得。(6)鈣指示劑：稱取0.10g鈣指示劑，加氯化鈉10g，放入潔凈研缽內(nèi)研磨成細(xì)粉，裝入玻璃瓶中備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鈣的測定方法

取250mL錐形瓶，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)液或待測液，加入蒸餾水50mL左右，加入2mol/LNaOH 2mL，加入鈣指示劑0.05g。用0.01mol/ L EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由紫紅色變?yōu)榧兯{(lán)色即為終點(diǎn)。根據(jù)EDTA 用量和樣品量求出鈣的含量。

2.2 樣品的制備

2.2.1 藥材樣品的制備 將黑順片、白附片、鹽附子、生附子粉碎至過二號篩，在60℃烘2小時，在干燥器中冷卻至室溫，依次精密稱取5.0045g、5.0028g、5.0023g、5.0017g置于瓷坩堝中，于電熱板上先低溫炭化至無煙，移入高溫爐中，于600℃灰化5.5小時，取出冷卻，加10%鹽酸溶液10mL使溶解，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用水洗滌容器多次，合并洗滌液于容量瓶中，用1mol/LNaOH調(diào)pH6～8，定容，制得0.1g/mL黑順片、白附片、鹽附子、生附子藥材的樣品溶液。

2.2.2 煎煮液樣品制備 分別精密稱取已粉碎成小顆粒的黑順片 10.00g、白附片 10.01g、鹽附子10.02g、生附子 10.02g分別裝于500mL圓底燒瓶中，加水100mL，加熱回流1小時，趁熱用濾布過濾，用清水洗滌殘渣3次，過濾，分別合并濾液。分別收集殘渣再加水100mL，加熱回流1小時，過濾，洗滌3次并過濾，分別合并濾液。將同一原料的前后兩次濾液合并，得到黑順片、白附片、鹽附子、生附子的水煎液。用蒸發(fā)皿將四種藥材的水煎液揮干并用高溫?zé)?，?mL 1mol/LHCl溶解，過濾于50mL容量瓶，用水多次洗滌殘渣，分別合并濾液，然后用1mol/LNaOH調(diào)濾液pH6～8，定容，制得0.2g/mL黑順片、白附片、鹽附子、生附子煎煮后的樣品溶液。

2.3 測定鈣的條件試驗(yàn)

2.3.1 EDTA的標(biāo)定 取250mL錐形瓶，加入5mL鈣標(biāo)準(zhǔn)液，加入蒸餾水50mL，加入2mol/L NaOH 2mL，加入鈣指示劑0.05g。用0.01mol/L EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由紫紅色變?yōu)榧兯{(lán)色即為終點(diǎn)。平行測定3次。將“加入5mL的鈣標(biāo)準(zhǔn)液”改為“加入5mL蒸餾水”，依法測定，記錄結(jié)果。平行測定3 次。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：“加入5mL鈣標(biāo)準(zhǔn)液”對應(yīng)的平均讀數(shù)是10.2mL?！凹尤?mL蒸餾水”對應(yīng)的平均讀數(shù)是0.3mL。

2.3.2 鈣指示劑的用量 實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)鈣指示劑低于0.04g時，顯色效果不明顯，顏色太淡；當(dāng)高于0.06g時，顏色太深，不好判斷終點(diǎn)。因此選用0.05g為指示劑的用量。

2.3.3 NaOH的用量 NaOH主要用來調(diào)節(jié)pH值，pH值為12.5時準(zhǔn)確度最高，重現(xiàn)性最好，因此選擇NaOH的用量為2mL。

3 測定結(jié)果及對比

取黑順片、白附片、鹽附子、生附子藥材樣品及煎煮液樣品，依鈣元素測定方法測定，平行測定3次，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1計算平均值；并進(jìn)行對比分析，對比分析如圖1。

溶出率計算：溶出率=（水煎液樣品中鈣元素含量 / 藥材樣品中鈣元素含量）×100%

表1 各樣品鈣元素測定結(jié)果(單位：mg/Kg)

圖1 附子各炮制品鈣元素的含量及溶出率對比

結(jié)果表明，附子不同炮制品藥材和水煎煮液中鈣元素含量由大到小依次為：鹽附子>黑順片>白附片>生附子；溶出率由高到低依次為：鹽附子>白附片>黑順片>生附子。

4 討論

4.1 從生附子及其炮制品藥材中鈣元素含量來看，炮制品中的鈣元素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生附子，因三種炮制品都經(jīng)過膽巴水的浸泡，而膽巴水中含有大量的鈣元素，鈣元素是此過程引入。而生附子中的鈣元素含量應(yīng)為其自身從土壤中獲得，因此幾種炮制品中鈣元素含量減去生附子當(dāng)中的鈣元素含量后得到的才是幾種炮制品在炮制過程中獲得的鈣元素含量。鹽附子中鈣元素含量最高，原因是雖然其炮制過程中與白附片、黑順片都經(jīng)過膽巴水溶液浸泡，但并未經(jīng)過漂洗，經(jīng)過漂洗后，鹽附子藥材中鈣元素含量為白附片藥材的56倍，為黑順片藥材的4倍。從溶出率來看，各炮制品差異明顯，其中白附片和黑順片溶出率較鹽附子低，主要原因也應(yīng)該是漂洗后使得膽巴水附著在藥材表面的含量降低，因此可以用溶出率來衡量炮制對藥材中無機(jī)元素含量的影響。

4.2 生附子經(jīng)過膽巴水浸泡后制為鹽附子，一方面為了方便保存，另一方面則是為了減毒增效。文獻(xiàn)[6]研究表明，鈣離子具有調(diào)整心律，降低毛細(xì)血管和細(xì)胞膜的通透性，維持體內(nèi)酸堿平衡的作用。而附子中的毒性成分烏頭類生物堿常常引起心律失常，鈣元素的引入可能就是為了制其毒性；當(dāng)然，膽巴水本身對人體具有毒性，過多的鈣元素引入亦可能會造成不良反應(yīng)，因此白附片和黑順片經(jīng)過漂洗后制得，其鈣元素含量均有所降低，在臨床上更為常用。由此可見，附子的炮制通過改變鈣元素含量可以使其更加安全有效以適合臨床應(yīng)用。

4.3 對附子不同炮制品中鈣元素含量研究的文獻(xiàn)并不多[7～14]，雖然報道不完整，仍可以看出炮制對中藥附子中鈣元素的含量影響很大。對中藥材中鈣元素含量測定方法常用的有容量分析法[15～16]、原子吸收分光光度法[17～18]、可見-紫外分光光度法[19]、毛細(xì)管電泳法[20]、ICP-AES法[21]等，本研究采用的EDTA滴定法測定附子不同炮制品中鈣元素含量未見報道，而結(jié)果與文獻(xiàn)[7]采用ICP-AES法報道附子炮制品中鈣含量大量增加相符，但與其生附子、白附片及黑順片的鈣元素含量相差較大，可能是測定方法差異及藥材產(chǎn)地、批次、炮制方法差異引起的，因此對更多附子不同產(chǎn)地、炮制品種及批次的藥材進(jìn)行研究和加以驗(yàn)證完善將是今后進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

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