付佩彩 喻志源 劉 淼 唐榮華 王 偉 駱 翔

小膠質(zhì)細(xì)胞約占成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總量的10%－20%［1］。它是CNS原位免疫細(xì)胞，屬于單核細(xì)胞系，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)感染、損傷等疾病的先天性免疫反應(yīng)［2］。在CNS受損后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活，遷移至受損部位，并發(fā)生一系列特征性反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、形態(tài)改變、炎性因子分泌等［3］。LPA為類生長(zhǎng)因子的脂類信號(hào)分子，與CNS損傷密切相關(guān)，它即是反應(yīng)CNS受損程度的預(yù)警因子，也可作為致病因子促進(jìn)CNS進(jìn)一步損傷［4，5］。本研究采用LPA對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)BV2細(xì)胞活化分泌IL－1β和TNF－α的濃度變化，以探討LPA在CNS損傷中對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及炎性因子分泌中的作用。

1 方法與材料

1.1 材料與試劑

BV2細(xì)胞系來(lái)自華中科技大同濟(jì)醫(yī)學(xué)院。DMEM／高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；多聚賴氨酸、LPA（溶血磷脂酸）和DAPI均購(gòu)自美國(guó)sigma公司；LDH試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所；ELISA試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；小鼠抗Iba1購(gòu)自美國(guó)Wako公司；CY3標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson公司。

1.2 BV2細(xì)胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)

液氮凍存的BV2細(xì)胞，37°C迅速?gòu)?fù)蘇后用含10%胎牛血清的DMEM／高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)用0.25%胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

調(diào)整BV2細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度為1×106／ml，接種于多聚懶氨酸（0.1 mg／ml）包被過(guò)的6孔板中，于37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。其中對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)換用新鮮培養(yǎng)基，LPA組換用含10μM LPA的新鮮培養(yǎng)基。

1.4 LDH法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH濃度

LDH法檢測(cè)10μM LPA作用于BV2細(xì)胞后培養(yǎng)基內(nèi)LDH含量，以檢測(cè)LPA對(duì)BV2細(xì)胞毒性作用。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求操作，反應(yīng)結(jié)束室溫5 min后用450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔相應(yīng)的LDH濃度。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中IL－1β和TNF－α濃度

ELISA法測(cè)定IL－1β和TNF－α濃度，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。終止反應(yīng)10分鐘內(nèi)用檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參考610 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔相應(yīng)的IL－1β和 TNF－α濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS軟件，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用sigma plot作圖軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 BV2細(xì)胞Iba1免疫熒光染色鑒定

傳代培養(yǎng)的BV2在培養(yǎng)24 h后貼壁細(xì)胞呈梭形，至第2～3 d BV2細(xì)胞生長(zhǎng)呈90%融合，突起明顯增多延長(zhǎng)。將BV2細(xì)胞做Iba1免疫熒光染色，證明傳代培養(yǎng)的BV2細(xì)胞表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗原Iba1（圖1）。

2.2 BV2細(xì)胞分泌LDH的濃度變化

對(duì)照組和LPA組在各時(shí)間點(diǎn)（30min、1、3和6 h）的LDH分泌均無(wú)明顯差異（圖2）。

2.3 BV2細(xì)胞分泌IL－1β和TNF－α的濃度變化

LPA干預(yù)BV2細(xì)胞后1 hIL－1β和TNF－α較對(duì)照組顯著增加（P＜0.01）。IL－1β分泌在3 h達(dá)到峰值，而TNF－α分泌在6 h內(nèi)持續(xù)增高。與對(duì)照組比較，IL－1β和TNF－α均在3 h增加最顯著（P＜0.01）（圖3、4）。

圖1 BV2細(xì)胞的小膠質(zhì)細(xì)胞特性鑒定 培養(yǎng)的BV2細(xì)胞100%表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗原Iba1；紅色為Iba1染色陽(yáng)性，藍(lán)色為細(xì)胞核DAPI染色

圖2 各組分泌LDH濃度

圖3 各組BV2細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF－α的濃度（與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，＊P＜0.01）

圖4 各組BV2細(xì)胞培養(yǎng)液中IL－1β的濃度（與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，＊P＜0.01）

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞為CNS定居的免疫細(xì)胞，是CNS損傷后最早發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞類型［6］?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)吞噬死亡細(xì)胞碎片、限制炎癥病灶擴(kuò)大［7］、形成胞突包繞神經(jīng)軸突末梢、分泌小膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等作用對(duì)CNS損傷起到保護(hù)作用。但過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞亦可導(dǎo)致神經(jīng)損傷，CNS缺血區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞可通過(guò) ATP、CCL2／CCR2趨化因子受體途徑以及組織蛋白酶S／CX3CL1途徑激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，分泌各種炎癥因子（TNF－α，IL－6，IL－1β）進(jìn)而加重受損神經(jīng)元的損傷［8～10］。雖然關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子釋放的研究眾多，但其炎性釋放機(jī)制仍未明確。

LPA是血清中的正常組分之一，血小板、炎癥細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、損傷細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受到各種刺激后均可生成，通過(guò)內(nèi)分泌和旁／自分泌的方式釋放。在CNS受損后LPA的分泌增加并可促進(jìn)CNS系統(tǒng)進(jìn)一步損傷，但其機(jī)制未明確［4，5］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPA可顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞的活化，并促進(jìn)其分泌IL－1β和TNF－α（P＜0.01），在3 h其促進(jìn)作用最為顯著。已知的LPA可通過(guò)G12／13蛋白激活Rho／ROCK信號(hào)通路［11］，LPA可通過(guò)激活Rho后發(fā)揮細(xì)胞骨架重建、肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維重建、細(xì)胞分化等作用。并有研究顯示抑制Rho／ROCK通路、可明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子（TNF－α、IL－6、IL－1β）釋放［12］。因此，本研究推測(cè)LPA促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性分泌可能為激活Rho／ROCK通路所致。

綜上所述，本研究結(jié)果提示LPA在小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其炎性分泌中發(fā)揮了重要作用；LPA促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子分泌可能為其促進(jìn)CNS損傷的原因之一，也為進(jìn)一步了解CNS損傷后LPA的作用、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化機(jī)制及其調(diào)控方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Lawson LJ，Perry VH，Dri P，et al.Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.Neuroscience，1990，39（1）：151－170.

2 Streit WJ，Conde JR，F(xiàn)endrick SE，et al.Role of microglia in the central nervous system＇s immune response.Neurol Res，2005，27（7）：685－691.

3 Haynes SE.The P2Y12 receptor regulates microglia activation by extracellular nucleotides.Nature Neurosci，2006，9（12）：1512－1519.

4 Siess W.Athero－and thrombogenic actions of lysophosphatidic acid and sphingosine－1－Phospate.Biochim Biophys Aeta，2002，1582（13）：204－215.

5 Siess W，Tigyi G.Thrombogenic and atherogenie activities of lysophosphatidic acid.J Cell Bioehem，2004，92（6）：1086－1094.

6 Hanisch UK，Kettenmann H.Microglia：active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.Nat Neurosci，2007，10（11）：1387－1394.

7 Davalos D.ATP mediates rapid microglia response to local brain injury in vivo.Nature Neurosci，2005，8（6）：752－758.

8 Gonzalez R，Glaser J，Liu MT，et al.Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury.Exp Neurol，2003，184（1）：456－463.

9 Pan W，Kastin AJ.Cytokine transport across the injured bloodspinal cord barrier.Curr Pharm Des，2008，14（16）：1620－1624.

10 Sharma HS.Pathophysiology of blood－spinal cord barrier in traumatic injury and repair.Curr Pharm Des，2005，11 （11）：1353－1389.

11 Kyoko Noguchi，Deron Herr，Tetsuji Mutoh.Lysophosphatidic acid（LPA）and its receptors.Neurosciences，2009，9（1）：15－23.

12 Jing Ding，Qin－Ying Li，Xin Wang，et al.Fasudil protects hippocampal neurons against hypoxia－reoxygenation injury by suppressing microglial inflammatory responses in mice.Journal of Neurochemistry，2010，114（6）：1619－1629.