張永剛 韓 梅 韓忠明 楊利民

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

北柴胡(Bupleurum chinenseDC.)為傘形科柴胡屬多年生草本植物，根部入藥，為我國傳統(tǒng)常用大宗中藥柴胡的重要基原［1］。在我國主要分布于東北、華北、西北及華東等地區(qū)，野生于較干燥的山坡、林緣、林中隙地、草叢及溝旁等處。目前，北柴胡野生資源迅速減少，供需矛盾突出。吉林省作為北柴胡重要產(chǎn)區(qū)，2001年引種吉林省東豐縣當(dāng)?shù)匾吧辈窈AP種植基地，開展了無公害規(guī)范化種植研究［2－4］。然而，栽培北柴胡存在種源混雜、產(chǎn)量不穩(wěn)、質(zhì)量下降等問題［5－6］，嚴重制約北柴胡生產(chǎn)。因此，開展北柴胡種質(zhì)資源研究，選育優(yōu)良品種，是優(yōu)化北柴胡品質(zhì)的根本措施，也是緩解野生資源壓力的有效途徑。本研究在前期工作基礎(chǔ)上［7－8］，開展了北柴胡新類型與原始類型農(nóng)藝和品質(zhì)性狀比較分析，旨在為選育北柴胡優(yōu)良品種，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)柴胡藥材提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

2003年引種GAP基地北柴胡栽培于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園，開展北柴胡群體變異性的多年觀察比較，按其葉片性狀差異確定了多個類型，后經(jīng)多代篩選確定寬葉型(KY)和長葉型(CY)2個新類型。本研究以北柴胡特異類型寬葉型和長葉型為供試材料，以原始類群中占絕對優(yōu)勢比例的中間型(ZY)為對照。原始類群北柴胡現(xiàn)為吉林省地方柴胡用種。各類型北柴胡均為2年生，采用隨機區(qū)組設(shè)計，重復(fù)3次，田間管理一致，僅進行人工除草，不施肥施藥、不澆水。

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國)，AUY220電子天平(日本);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，甲醇(國產(chǎn)分析純)，氨水(國產(chǎn)分析純)，高純水，柴胡皂苷a、d對照品(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，純度98%)。

農(nóng)藝性狀調(diào)查:2008年調(diào)查北柴胡各類型株高，主莖葉長、葉寬、莖徑，根長、根徑、根質(zhì)量。根部性狀調(diào)查自2008年7月30至9月26日共5次取樣，測量根長、根徑后，置烘箱內(nèi)50℃烘干，稱干質(zhì)量，密封保存。

柴胡皂苷a、d質(zhì)量分數(shù)測定，參考楊志業(yè)等［9］的方法，并加以改進。

供試品溶液制備:各類型北柴胡干燥根粉碎，過40目篩。準(zhǔn)確稱取各樣品粉末0.5 g，濾紙包好置于索氏提取器中，加5%氨水甲醇溶液50 mL，80℃回流提取2 h。提取液置于50 mL容量瓶中，用5%氨水甲醇溶液定容至刻度，取25 mL水浴揮干，精密加入甲醇4 mL溶解，臨用前吸取適量過0.2 μm濾膜。精密吸取濾液20 μL作HPLC分析。

色譜條件:Agilent Eclipse XDB－C18色譜柱(4.5 mm×150 mm，5 μm);流動相為乙腈—水;流速1 mL·min－1;洗脫梯度(0～15 min，乙腈比例10% ～30%;15～40 min，乙腈比例30% ～40%);柱溫25℃，檢測波長205 nm;進樣量20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍:精密稱取柴胡皂苷a(ssa)、柴胡皂苷 d(ssd)對照品各7.9 mg，分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。各取等量混合，制成混合對照品溶液。分別精密吸取1、2、4、8、12、16、20 μL 進樣，按上述色譜條件作 HPLC分析，以峰面積對進樣量(μg)進行線性回歸處理，得到 ssa回歸方程Y=471.004 383X+61.169 832(r=0.999 8)，線性范圍0.79 ～15.8 μg;ssd 回歸方程Y=384.899 437X+55.912 519(r=0.999 7)，線性范圍0.79 ～15.8 μg。

精密度試驗:吸取上述混合對照品溶液按同樣色譜條件進行HPLC分析，每次20 μL，重復(fù)5次，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RS，D)。結(jié)果ssa、ssd質(zhì)量分數(shù)的RS，D分別為 1.24%、1.44%(n=5)。表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗:精密稱定同一供試品，按供試品溶液制備方法分別平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件進行HPLC分析，記錄峰面積，ssa、ssd質(zhì)量分數(shù)的RS，D分別為 2.91% 、2.71%(n=5)。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h上述色譜條件下測定。結(jié)果ssa、ssd質(zhì)量分數(shù)的RS，D分別為 1.18%、1.34%，表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗:采用加樣回收法，精確稱取已知質(zhì)量分數(shù)的柴胡樣品5份，加入一定量的混合對照品，按供試品溶液方法制備，以同樣的色譜條件進行HPLC分析，計算其平均回收率分別為97.34%、98.03%，RS，D分別為 0.99% 、1.99% 。

樣品測定:按上述供試品溶液制備和色譜條件進行各樣品測定，記錄柴胡皂苷a、d的峰面積，計算質(zhì)量分數(shù)。典型HPLC圖見圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要農(nóng)藝性狀比較

各類型主要性狀特征見表1。CY株高最大，對比另外2個類型達極顯著水平;KY株高的RS，D值最小，說明其株高比較穩(wěn)定;ZY株高的RS，D值最大，其株高變化較大。莖徑性狀上，CY和KY對比ZY差異極顯著;CY顯著高于KY。葉片特征表現(xiàn)為CY葉片最長，KY葉片最寬，ZY葉寬變化幅度較小;葉長寬比由大到小的順序為CY、ZY、KY，各類型間差異極顯著。另外，調(diào)查期內(nèi)平均根徑、根長以KY和CY較大，二者均與ZY差異達極顯著水平。

圖1 北柴胡柴胡皂苷HPLC圖譜

表1 北柴胡各類型主要農(nóng)藝性狀

2.2 產(chǎn)量與品質(zhì)性狀動態(tài)比較

各類型的產(chǎn)量與品質(zhì)性狀見表2。各類型單根干質(zhì)量在調(diào)查期內(nèi)均呈增加趨勢。CY和KY單根干質(zhì)量增長較為迅速，9月中下旬單根干質(zhì)量均達到2 g以上，二者差異不顯著，寬葉型表現(xiàn)出良好的穩(wěn)產(chǎn)性。ZY單根干質(zhì)量增長緩慢，至9月中下旬單株根干質(zhì)量在0.6 g左右。CY和KY對照ZY差異極顯著，為ZY 的3.6～3.8倍。

CY和ZY的ssa、ssd及(ssa+ssd)質(zhì)量分數(shù)在取樣調(diào)查期內(nèi)呈波動性變化，總體呈現(xiàn)先逐漸增加，后降低的趨勢。而KY則總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，至9月中旬達最低，而后有所增加。CY與KY的ssa質(zhì)量分數(shù)差異不顯著，但對照ZY均達極顯著差異，分別是ZY的1.7倍和1.5倍。ssd及(ssa+ssd)質(zhì)量分數(shù)均以ZY最高，對照CY和KY均達極顯著差異;ZY的ssd質(zhì)量分數(shù)分別是CY和KY的2.2倍和4.3倍，(ssa+ssd)質(zhì)量分數(shù)分別是CY和KY的1.6倍和2.5倍。同時，CY與KY的ssd及(ssa+ssd)質(zhì)量分數(shù)差異均達到顯著水平。

調(diào)查期內(nèi)，各類型單根(ssa+ssd)收量(單根干質(zhì)量×(ssa+ssd)質(zhì)量分數(shù))總體呈逐漸增加趨勢，與根干質(zhì)量變化趨勢相對一致，僅KY和ZY在9月中旬微減。調(diào)查期始末單根(ssa+ssd)收量提高幅度以CY最大，增加178%;ZY次之，為98.5%;KY僅增加43.4%。對調(diào)查期內(nèi)各類型單根(ssa+ssd)收量進行方差分析，CY和KY對照ZY分別達極顯著和顯著差異。9月末CY和KY單根(ssa+ssd)收量分別是ZY的2.2倍和1.5倍，各類型間差異達極顯著水平。

表2 北柴胡各類型單根產(chǎn)量及品質(zhì)性狀動態(tài)變化

2.3 北柴胡根干質(zhì)量及根徑與柴胡皂苷質(zhì)量分數(shù)和收量的相關(guān)性

北柴胡根干質(zhì)量、根徑與(ssa+ssd)質(zhì)量分數(shù)呈極顯著負相關(guān)(R0.01=0.641 1)，與楊成民等［11］、張軍［12］的研究結(jié)論相一致，相關(guān)系數(shù)分別為－0.854 9和－0.841 7;根干質(zhì)量、根徑與單根(ssa+ssd)收量變化呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別達0.784 5和0.743 2(圖2)。

圖2 北柴胡根干質(zhì)量及根徑與柴胡皂苷質(zhì)量分數(shù)和收量的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

柴胡皂苷a和柴胡皂苷d是中藥柴胡主要藥效成分，其總量是判斷藥材優(yōu)劣的重要指標(biāo)，本研究中不同類型北柴胡所含柴胡皂苷a和柴胡皂苷d總量均遠超《中國藥典》2010年版一部中規(guī)定0.30%的最低標(biāo)準(zhǔn)。方差分析表明，不同類型柴胡藥材中柴胡皂苷a和d總量變化較大，中間型顯著高于其他2個新類型。另外，結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，各類型北柴胡乙醇浸出物均高于《中國藥典》11%的標(biāo)準(zhǔn)，且中間型最高［7］。從有效成分質(zhì)量分數(shù)角度看，中間型可以作為優(yōu)良類型加以培育。

鄭亭亭等［10］認為困擾柴胡生產(chǎn)的最重要因素是種植柴胡產(chǎn)量較低，其選育柴胡平均單根質(zhì)量不超過1 g。本研究中間型北柴胡單根質(zhì)量低于1 g，而2個新類型均達到2 g，新類型產(chǎn)量對比中間型差異顯著。圖2的相關(guān)性分析表明，北柴胡根部產(chǎn)量的增速要大于柴胡皂苷質(zhì)量分數(shù)減速，使得柴胡皂苷的收量持續(xù)增加。寬葉型和長葉型可以作為高產(chǎn)類型加以培育。

藥用植物作為一類具有醫(yī)療保健價值的特殊用途植物，其產(chǎn)量、有效成分質(zhì)量分數(shù)和收量是評價藥材質(zhì)量、最佳采收期和篩選核心種質(zhì)的主要依據(jù)［11，13－14］。北柴胡不同類型間農(nóng)藝性狀及有效成分差異顯著，說明北柴胡表型變異已引起藥材化學(xué)成分的變化。這為北柴胡品種選育工作提供了豐富材料，通過優(yōu)良變異類型篩選，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)北柴胡栽培品種具有可行性。

本研究認為，北柴胡寬葉型和長葉型具有較高的產(chǎn)量和柴胡皂苷收量，適宜以提取有效成分為主的現(xiàn)代中藥生產(chǎn);中間型產(chǎn)量低，但柴胡皂苷質(zhì)量分數(shù)高，適宜以炮制柴胡飲片為主的傳統(tǒng)中藥生產(chǎn)。可以有針對性的選育北柴胡優(yōu)良品種，以滿足不同開發(fā)利用層次的需求。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版:1部［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:263.

［2］于英，王秀全，包玉曉，等.北柴胡生長發(fā)育規(guī)律的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25(5):523－527.

［3］于英，王秀全，張永剛，等.北柴胡生長關(guān)鍵期主要性狀的遺傳參數(shù)及育種應(yīng)用［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，28(4):415－418.

［4］于英，王秀全，劉霞，等.摘花序、打頂對北柴胡生育性狀及根部產(chǎn)量的影響［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25(3):303－306.

［5］朱再標(biāo)，梁宗鎖，楊東風(fēng)，等.北柴胡藥材質(zhì)量分析與評價［J］.中國中藥雜志，2008，33(5):586－589.

［6］楊成民，崔璐瑩，魏建和，等.3種柴胡種質(zhì)花器外觀形態(tài)與小孢子發(fā)育時期關(guān)系研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(17):2191－2193.

［7］韓梅，王少江，楊利民，等.柴胡變異類型主要遺傳性狀的比較研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，28(6):639－643.

［8］王秀全，李玉新，李會成，等.北柴胡種源道地性的RAPD分析［J］.中藥材，2003，26(12):855－856.

［9］楊志業(yè)，劉書芬，晁志，等.HPLC測定新疆柴胡屬4種植物中柴胡皂苷 a、c、d 的含量［J］.中國中藥雜志，2008，33(4):460－461.

［10］鄭亭亭，隋春，魏建和，等.北柴胡二代新品種“中柴2號”和“中柴3號”的選育研究［J］.中國中藥雜志，2010，35(15):1931－1934.

［11］楊成民，魏建和，程惠珍，等.北柴胡皂苷含量動態(tài)變化［J］.中藥材，2006，29(4):316－318.

［12］張軍.不同粗細北柴胡根部的柴胡皂苷含量比較［J］.中藥通報，1985，10(4):157－158.

［13］黃璐琳，胡尚欽，江懷仲，等.淺談藥用植物良種選育的目標(biāo)和常規(guī)途徑［J］.世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2003，5(2):59－62.

［14］馬小軍，肖培根.種質(zhì)資源遺傳多樣性在藥用植物開發(fā)中的重要意義［J］.中國中藥雜志，1998，23(10):579－581.