田亞新 王運(yùn)來 韓曉云 劉繼偉 康傳紅

(黑龍江大學(xué)，哈爾濱，150080)

我國具有豐富的沙棘資源，在沙棘的根、莖、葉、果實(shí)中均有天然原花色素，其中以沙棘籽中原花色素的含量最高。原花色素是一類黃烷－3－醇類單體及其C4－C8或C4－C6鍵連接而成聚合體的多羥基酚類化合物，分子骨架為C6C3C6［1］，是植物生長過程中的次生代謝產(chǎn)物，因在酸性介質(zhì)中加熱能產(chǎn)生花色素(anthocyanidin)而得名［2］，因其聚合體表現(xiàn)出單寧特性，因此也稱縮合單寧。原花色素具有良好的清除自由基、抗氧化和抗癌等生物活性，已廣泛的應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。沙棘原花色素的生物活性跟其聚合度密切相關(guān)，多聚原花色素因其分子量較大和位阻效應(yīng)影響了酚羥基的活性［3］，導(dǎo)致其生物活性降低，而天然植物中的原花色素多以多聚體形式存在，因此，原花色素的降解研究受到廣泛關(guān)注。目前，研究較多的原花色素的降解方法有催化氫解［4］、微生物降解、亞硫酸降解等方法［5］，相對(duì)比較亞硫酸降解方法具備操作簡單、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，更適合于規(guī)模生產(chǎn)。因此，文中采用亞硫酸作為降解試劑，尋求最佳降解條件。

1 材料與方法

沙棘籽，沙棘采自黑龍江省阿城縣，使用組織搗碎機(jī)破壞果肉，篩取沙棘籽干燥，再經(jīng)組織搗碎機(jī)粉碎，過60目篩后備用。

沙棘籽原花色素粗提品制備:取干燥的沙棘籽粉20 g，加入一定量的石油醚，在回流裝置中20℃脫脂5 h，自然揮發(fā)除去殘余石油醚，得到脫脂沙棘籽粉。稱取20 g脫脂沙棘籽粉進(jìn)行原花色素粗提，提取條件為60%酒精、料液比為1∶8(g∶L)、pH值為3、提取溫度為20℃，提取60 min(重復(fù)3次，合并提取液)，過濾，離心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液，得到原花色素粗提品。

沙棘籽原花色素亞硫酸降解單因素優(yōu)化:60%乙醇溶解沙棘籽原花色素作為待降解溶液。取待降解液，加入一定量亞硫酸，按照設(shè)定溫度進(jìn)行水浴降解。取降解后溶液1 mL，分別用甲醇和乙酸定容至2 mL，測(cè)定其500 nm吸光度值，計(jì)算出其平均聚合度。分別改變降解溫度、降解時(shí)間、料液比和亞硫酸用量，考察各因素對(duì)原花色素降解效果的影響。

式中:DP為平均聚合度;m為原花色素質(zhì)量(μg);n為原花色素物質(zhì)的量(μmol);M為單體(+)－兒茶素的相對(duì)分子質(zhì)量。原花青素的質(zhì)量按照傳統(tǒng)的香草醛—鹽酸法測(cè)得，物質(zhì)的量則用香草醛—乙酸的方法測(cè)定［7］。

沙棘籽原花色素亞硫酸降解條件優(yōu)化:根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、料液比、亞硫酸用量為優(yōu)化因素，按照均勻設(shè)計(jì)表U11(1110)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。按照單因素的試驗(yàn)流程進(jìn)行降解試驗(yàn)，測(cè)定原花色素的質(zhì)量和摩爾量，計(jì)算平均聚合度，以平均聚合度為試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到最佳試驗(yàn)方案和預(yù)測(cè)值。最后按照均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化得到的試驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硫酸降解原花色素的單因素條件優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)降解效果的影響

為考查溫度對(duì)亞硫酸降解效果的影響，分別在溫度為50、60、70、80、90 ℃ 條件下進(jìn)行水浴降解反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明:在反應(yīng)時(shí)間、料液比、亞硫酸用量一定時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的增加，平均聚合度逐漸降低，降解程度也逐漸增加。其中50～60℃變化最為劇烈，60℃以后變化趨緩，在溫度達(dá)到80℃時(shí)平均聚合度降至最低，原花色素降解效果最佳。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)降解效果的影響

原花青素的降解需要時(shí)間，為了考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)降解效果的影響，分別在降解時(shí)間為30、60、90、120、150 min條件下，檢測(cè)降解效果。試驗(yàn)結(jié)果表明:隨著時(shí)間的延長平均聚合度降低，最初降解速率最快，30～60 min平均聚合度下降了10%左右，此后降解變慢，120 min時(shí)平均聚合度達(dá)到最低。

2.1.3 料液比對(duì)降解效果的影響

為考查料液比對(duì)亞硫酸降解效果的影響，配置料液比分別為1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11、1 ∶12(g ∶L)，進(jìn)行水浴降解反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明:在其他條件不變時(shí)，隨著料液比的增加，平均聚合度有降低趨勢(shì)，但當(dāng)料液比超過1∶9后，變化不明顯。

2.1.4 亞硫酸用量對(duì)降解效果的影響

亞硫酸作為降解劑，其用量對(duì)降解效果應(yīng)該有一定的影響，在保證反應(yīng)體系總體積一定的情況下，分別加入 0、1、2、3、4 mL 的亞硫酸，考察亞硫酸用量對(duì)降解效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明:在反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、料液比一定時(shí)，隨著亞硫酸用量的增加，平均聚合度逐漸降低，當(dāng)亞硫酸用量為1 mL時(shí)，平均聚合度為最低值。

2.2 均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化原花色素降解條件

通過原花色素單因素優(yōu)化結(jié)果表明，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、料液比和亞硫酸用量對(duì)降解都具有一定的影響。為了綜合考察各種影響因素，采用均勻設(shè)計(jì)法進(jìn)一步進(jìn)行降解條件優(yōu)化。按照均勻設(shè)計(jì)表U11(1110)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，以平均聚合度為考察指標(biāo)，進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化。優(yōu)化方案及結(jié)果見表1。

表1 沙棘籽原花色素亞硫酸降解均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化方案及試驗(yàn)結(jié)果

按照表1數(shù)據(jù)，利用Excel中的Linest函數(shù)分別建立針對(duì)表1中各因素一次一元回歸方程、二次一元回歸方程、一次二元回歸方程，判斷復(fù)相關(guān)系數(shù)(R2，越接近1越好)，以及比較F統(tǒng)計(jì)值與置信度分別為0.05、0.01的臨界F值(通過 Finv函數(shù)計(jì)算)的大小(F統(tǒng)計(jì)值應(yīng)大于臨界F值)，優(yōu)選以上回歸方程，并再次利用Linest函數(shù)形成新的回歸方程為:y=0.000172x+18.730814x－0.000038x1x2x3+0.002352x1x3+0.000971x1x2－0.111792x1－0.040954x2+0.096 241x3－7.109 051x4+5.771 492，其中x1代表反應(yīng)溫度(℃);x2代表反應(yīng)時(shí)間(min);x3代表料液比;x4代表亞硫酸用量。

經(jīng)計(jì)算，F(xiàn)統(tǒng)計(jì)值為22.35，置信度為0.01時(shí)的臨界F值為11.39，置信度為0.05時(shí)的臨界F值為5.19，F(xiàn)統(tǒng)計(jì)值大于臨界F值;R2=0.95，比較接近于1。由F統(tǒng)計(jì)值和R2值可以得出結(jié)論，得到的回歸方程顯著性較好。

利用Qbasic程序，預(yù)測(cè)到最佳降解時(shí)間為60 min、降解溫度為80℃、料液比為1∶8、亞硫酸體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，得到最低平均聚合度。按照以上方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，降解前平均聚合度為13.42，降解后平均聚合度為7.53，降解效果明顯。

3 結(jié)束語

考慮到試驗(yàn)研究所考察的水平數(shù)較多，文中在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。均勻設(shè)計(jì)方法是一個(gè)空間填充設(shè)計(jì)方法，尋求試驗(yàn)數(shù)值點(diǎn)內(nèi)的均勻分散，其在合理的試驗(yàn)組數(shù)內(nèi)能夠暴露出各個(gè)因素以及因素之間對(duì)結(jié)果的影響情況，具有節(jié)約性、穩(wěn)定性和靈活性等特點(diǎn)，目前，已在多個(gè)領(lǐng)域內(nèi)廣泛應(yīng)用。試驗(yàn)結(jié)果表明，均勻設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案合理，結(jié)果可靠。

亞硫酸降解方法具備降解效率高、操作簡單、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，非常適合于工業(yè)化生產(chǎn)。但是，考慮到沙棘籽原花色素主要用于食品和藥品，降解后亞硫酸的去除是一個(gè)非常值得重視的問題，需要科學(xué)工作者進(jìn)一步地研究和探討。

［1］Prieur C，Rigaud J，Cheynier V，et al.Oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds［J］.Phytochemistry，1994，36(3):781－784.

［2］Gabetta B，F(xiàn)uzzati N，Griffini A，et al.Characterization of proanthocyanidins from grape seeds［J］.Fitoterapia，2000，71(2):162－175.

［3］Jorge M.Ricardo D S，Darmon N，et al.Oxygen free radical scavenger capacity in aqueous models of different procyanidins from grape seeds［J］.J Agric Food Chem，1991，39(9):1549－1552.

［4］杜曉，唐偉，廖學(xué)品，等.落葉松多聚原花色素的Pd/C催化氫解反應(yīng)研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2005，17(4):456－459.

［5］劉文潔，戴晶晶，周興燕，等.葡萄籽原花青素化學(xué)降解工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(7):229－231.

［6］田亞新.沙棘籽原花色素提取分離及性質(zhì)研究［D］.哈爾濱:黑龍江大學(xué)，2008.

［7］姚開，何強(qiáng)，呂遠(yuǎn)平，等.葡萄籽提取物中原花青素含量的測(cè)定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28(3):17－19.