劉川鄂 吳述軒 葉 剛

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

糖尿病患者圍術(shù)期并發(fā)癥和死亡率高于非糖尿病患者［1］，與其病理生理機(jī)制有關(guān)：糖尿病伴隨的逐漸加劇的氧化應(yīng)激損傷、糖尿病狀態(tài)下高血糖與蛋白質(zhì)形成的糖基化終末產(chǎn)物、增強(qiáng)多元醇路徑導(dǎo)致超氧陰離子（O2-）自由基的生成、PI3K活性降低等有關(guān)［2-3］。已有研究表明，人參皂苷Rb1做為參附注射液的主要有效成分，可以減輕糖尿病心肌缺血再灌注損傷［4］，但對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制未明。本研究通過(guò)觀察人參皂苷Rb1預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡及心肌磷酸化Akt（p-Akt）表達(dá)的影響，探討其減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注期間心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2004-0007。

1.2 試藥與儀器 藥品：人參皂苷Rb1（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；Wortmaninn（Sigma 公司）；細(xì)胞凋亡試劑盒（Roche 公司）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（Sigma 公司）；兔抗鼠 Akt多克隆抗體（Cellsignaling Technology）。儀器：DW-2000型動(dòng)物呼吸機(jī) （上海嘉鵬科技有限公司）；Olympus BX50顯微攝影系統(tǒng)（Olympus公司）；恒溫?fù)u床 （成都儀器廠）；-80℃深低溫冰箱（SANYO 公司）；V30掃描儀（Epson公司）

1.3 模型制備 大鼠禁食12 h，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）65 mg/kg，72 h后測(cè)定空腹血糖，連續(xù)8周空腹血糖＞16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，即為1型糖尿病模型制備成功。此后每2周測(cè)定1次空腹4 h血糖和體質(zhì)量，糖尿病大鼠自由飲水，普食飼養(yǎng)8周后制備心肌缺血/再灌注模型。大鼠腹腔注射巴比妥鈉（50 mg/kg）后實(shí)行氣管切開，機(jī)械通氣。置皮下電極監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，右側(cè)股靜脈穿刺給藥。左胸第4肋間行開胸術(shù)后，切除心包膜暴露心臟，距左心耳下緣2 mm以6-0尼龍線結(jié)扎左冠動(dòng)脈前降支（LAD）。LAD結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)為：左心室變白，心電圖提示ST段抬高。結(jié)扎30 min后，松開結(jié)扎線以恢復(fù)血流，再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)為：ST段回落，左心室復(fù)紅。

1.4 分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為模型組、聯(lián)合組（人參皂苷Rb1+Wortmaninn）、人參皂苷Rb1組、Wortmaninn組，每組10只。模型組結(jié)扎LAD 30 min后恢復(fù)灌注120 min。Wortmaninn組于缺血前20 min，按15 μg/kg給予Wortmaninn；人參皂苷 Rb1組于缺血前10 min按40 mg/kg給予人參皂苷Rb1；聯(lián)合組分別于缺血前20、10 min，給予相同劑量的Wortmaninn和人參皂苷Rb1。Wortmannin和人參皂苷Rb1劑量參閱文獻(xiàn)［5-6］。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 心肌梗死面積測(cè)定：再灌注結(jié)束后，再次結(jié)扎LAD，經(jīng)股靜脈注入2 mL 1%濃度的依文思藍(lán)，依文思藍(lán)使非缺血區(qū)染色，用來(lái)評(píng)估缺血區(qū)面積，快速取出大鼠心臟冷凍后使用心臟切片槽將心臟垂直于心臟長(zhǎng)軸切為2 mm厚心肌片，置于TTC溶液室溫育15 min，缺血區(qū)心肌呈磚紅色，梗死區(qū)心肌呈灰白色；心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定：制備心肌組織石蠟切片，采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，每一切片選擇10個(gè)高倍鏡視野，TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞細(xì)胞核被染成棕褐色；心肌Akt、p-Akt的測(cè)定：免疫印跡（westernblot）對(duì)p-Akt的測(cè)定。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)掃描，確定蛋白條帶密度的相對(duì)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌梗死區(qū)百分比和心肌凋亡細(xì)胞百分比比較 見表1。與模型組比較，人參皂苷Rb1組心肌梗死區(qū)百分比和凋亡細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rb1組比較，聯(lián)合組心肌梗死區(qū)百分比和凋亡細(xì)胞百分比明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌梗死區(qū)百分比和心肌凋亡細(xì)胞百分比比較（%，±s）

表1 各組大鼠心肌梗死區(qū)百分比和心肌凋亡細(xì)胞百分比比較（%，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與人參皂苷Rb1組比較，△P＜0.05。

組 別 n 梗死區(qū) 凋亡細(xì)胞模型組 10 53.37±5.45 30.70±4.96人參皂苷 Rb1組 10 42.43±6.70* 26.15±3.06*聯(lián)合組 10 55.65±7.37△ 31.32±4.39△Wortmaninn 組 10 54.03±6.90 34.15±3.46

2.2 各組p-Akt表達(dá)比較 給予人參皂苷Rb1后，人參皂苷Rb1組 p-Akt表達(dá)（154.5±33.12）明顯高于模型組（90.3±13.02）（P＜0.05）；而在給予Wortmannin后聯(lián)合組大鼠心肌p-Akt（97.3±15.03）顯著低于人參皂苷 Rb1組（154.5±33.12）（P＜0.05）。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過(guò)程，它的發(fā)生受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控。PI3K-Akt信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過(guò)影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用［5］。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第3位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性。Akt是分子量約為57KU的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要節(jié)點(diǎn)。近年來(lái)研究表明，PI3K-Akt能經(jīng)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。PI3KAkt信號(hào)通路抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要有：（1）直接調(diào)節(jié)作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞凋亡是多級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過(guò)程。BAD是Bcl-2家族成員之一，可與Bcl-2或Bcl-xl形成復(fù)合體而表現(xiàn)促凋亡活性。Akt是強(qiáng)有力的BAD激酶，活化的Akt可以使BAD的Ser136位點(diǎn)磷酸化，有效阻斷BAD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。當(dāng)用特異的PI3K抑制劑Wortmaninn處理后，Akt引起的BAD磷酸化受阻［6］；（2）通過(guò)直接或間接影響轉(zhuǎn)錄因子家族（Forkhead、NF-κB、p53等）發(fā)揮細(xì)胞存活調(diào)控作用。磷酸化的Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子能降低FasL的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡。Vandermoere等［7］研究證明Akt能夠直接或間接調(diào)節(jié)IKK的活性，導(dǎo)致NF-κB的核轉(zhuǎn)位、活化和NF-κB依賴的促進(jìn)存活基因的轉(zhuǎn)錄。Akt使NF-κB磷酸化后，激活它的轉(zhuǎn)錄功能，使促進(jìn)細(xì)胞存活的Bcl-2家族成員Bcl-xl表達(dá)增強(qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。（3）防止線粒體釋放凋亡因子。線粒體可釋放細(xì)胞色素c及凋亡誘導(dǎo)因子，Akt可阻止其釋放從而起到抗細(xì)胞凋亡的作用［8］。

本研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下給予人參皂苷Rb1治療大鼠心肌p-Akt表達(dá)明顯增加，心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡明顯減少；而給予PI3K抑制劑Wortmannin后，p-Akt表達(dá)明顯減少，人參皂苷Rb1促進(jìn)p-Akt表達(dá)的作用明顯抑制，Rb1減少梗死面積和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用也被消除。這表明，人參皂苷Rb1可以在糖尿病大鼠心肌通過(guò)激活PI3K促進(jìn)p-Akt的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷。此外，人參皂苷Rb1具有清除氧自由基、阻斷細(xì)胞鈣超載藥理效應(yīng)，可能是其間接抑制心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

［1］Trichon BH，Roe MT.Acute coronary syndromes and diabetes mellitus［J］.Diab Vasc Dis Res，2004，1（1）：23-32.

［2］Pacher P，Obrosova IG，Mabley JG，et al.Role of nitrosative stress and peroxynitrite in the pathogenesis of diabetic complications［J］.Curr Med Chem， 2005，12（3）：267-275.

［3］El-Remessy AB，Bartoli M，Platt DH.Oxidative stress inactivates VEGF survival signaling in retinal endothelial cells via PI3-kinase tyrosine nitration［J］.J Cell Sci， 2005，118（Pt 1）：243-252.

［4］張力，夏中元.人參皂苷Rb1預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2010，12（3）：446-449.

［5］Huisamen B.Protein kinase B in the diabetic heart［J］.Mol Cell Biochem，2003，249（1-2）：31-38.

［6］Song G，Ouyang GL，Bao SD.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survial［J］.J Cell Mol Med，2005，9（1）：59-71.

［7］Vandemoere F，E1 Yazidi-Beiloural Adriaenssens E，et al.The antiapoptotic effect of fibroblast growth factor-2 is mediated through muclear factor B activation induced via interaction between Akt and Kinase-βinbreastcancercells［J］.Oncogence，2005，24（35）：5482-5491.

［8］Kim EC，Yun BS，Ryoo IJ，et al.Complestatin prevents apoptotic cell death：inhibitionofamitochondrial caspasepathwaythrough AKT/PKB activation［J］.BiochemBiophysResCommun，2004，313（1）：193-204.